Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:26 min. • July 8th, 2025
Comece com um cérebro de camundongo neonatal e transfira-o para um tubo contendo uma solução enzimática proteolítica.
As enzimas degradam a matriz extracelular do tecido e iniciam a dissociação celular.
Lave repetidamente o tecido digerido com um meio de crescimento para remover as enzimas.
Use uma pipeta de diâmetro maior para mover o tecido repetidamente através da pipeta para dissociá-lo em fragmentos menores.
Em seguida, usando uma pipeta de menor diâmetro, continue a dissociar os fragmentos, criando uma suspensão celular.
Filtre esta suspensão para remover aglomerados de células e obtenha uma suspensão unicelular contendo neurônios primários e uma população mista de células gliais, incluindo microglia e astrócitos.
Semear as células num balão de cultura contendo um meio de cultura e incubar para promover a sua aderência.
Com o tempo, a ausência de fatores de crescimento de neurônios na mídia causa a morte neuronal.
Substitua a mídia gasta por mídia nova. As células gliais utilizam os nutrientes e proliferam, gerando uma cultura glial mista de astrócitos e micróglia.
Transfira o cérebro para um tubo de 50 mililitros contendo 2 mililitros de tripsina-EDTA a 0,25% e incube por 15 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Lave o cérebro com meio de crescimento fresco, adicionando e removendo o meio. Após a conclusão das lavagens, adicione 2 mililitros de meio de crescimento por cérebro e homogeneize triturando o cérebro.
Quando o tecido cerebral não diminuir, faça a transição para uma pipeta com uma abertura menor. No final da titulação, quando a suspensão estiver límpida, sem pedaços visíveis, passe a suspensão por um filtro de células de 70 mícrons para criar uma cultura de célula única.
Em seguida, pipetar 8 a 9 milímetros de meio de crescimento para frascos T75, dois frascos por cérebro, e adicionar 1 mililitro de homogeneizado cerebral a cada frasco. Cultive as células até o isolamento no 16º dia.