Obtenção de várias populações de células neurais de um hipocampo de rato

Pegue fragmentos de hipocampo de ratos perfundidos.

Incube com papaína para digerir a matriz extracelular do tecido e soltar as células, incluindo neurônios, astrócitos e microglia.

Adicione DNase e misture.

Dissociar mecanicamente o tecido usando pipetas de diâmetros progressivamente decrescentes para obter uma suspensão unicelular. Incube para que a DNase degrade o DNA contaminante.

Passe a suspensão por uma peneira, removendo os detritos.

Adicione tampão contendo íons divalentes para interromper a atividade enzimática.

Centrifugue e remova o sobrenadante rico em enzimas.

Agora, adicione tampão e esferas magnéticas anti-mielina. Incube para que as contas se liguem aos detritos de mielina.

Após a incubação, centrifugue e remova o sobrenadante.

Ressuspender a mistura em tampão e colocá-la numa coluna de separação magnética contendo esferas ferromagnéticas colocadas no campo magnético do classificador magnético.

O campo magnético retém detritos de mielina ligados a esferas magnéticas na coluna enquanto as células livres de mielina passam.

Lave a coluna com tampão e colete o fluxo contendo neurônios, astrócitos e microglia.

Comece a dissociação neural usando lâminas de barbear estéreis para cortar cada amostra colhida de tecidos cerebrais adultos em pequenos pedaços de 30 a 400 miligramas na tampa de uma placa de cultura de seis poços. Em seguida, mergulhe o tecido em 1 mililitro de HBSS livre de cálcio e magnésio e use uma pipeta para transferir as amostras para tubos de centrífuga estéreis de 2 mililitros.

Quando todos os tecidos tiverem sido coletados, centrifugue as amostras e aspire os sobrenadantes e incube as amostras por 15 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius, invertendo o tubo várias vezes a cada cinco minutos para ressuspender os pedaços de tecido assentados.

No final da incubação, adicione 30 microlitros de tubo misturado com enzimas recém-preparado a cada amostra e inverta suavemente os tubos. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur rotulada como 1, dissocie cada amostra com trituração 30 para cima e para baixo, tomando cuidado para evitar a geração de bolhas. Incubar as amostras por mais 15 minutos a 37 graus Celsius com inversão a cada cinco minutos, seguida de dissociação das amostras com pipeta Pasteur número 2, como acabamos de demonstrar.

Em seguida, mude para a pipeta número 3. Repetir a dissociação e incubar as amostras por mais 10 minutos em banho-maria, com inversão a cada cinco minutos. No final da incubação, filtre as suspensões de célula única através de filtros de células de 80 mícrons em tubos Falcon de 15 mililitros, lavando cada filtro com 10 mililitros de HBSS livre de cálcio e magnésio para interromper as reações enzimáticas. Quando a última amostra tiver sido filtrada, gire os tubos e aspire os sobrenadantes.

Para esgotar a mielina das suspensões celulares, ressuspenda completamente os pellets em 400 microlitros de tampão de remoção de mielina e adicione a quantidade apropriada de grânulos de remoção de mielina a cada tubo. Pipete as soluções para cima e para baixo até que as células e os grânulos estejam bem misturados. Em seguida, incube a amostra a 4 graus Celsius por 15 minutos. Após a incubação, lave cada amostra em 5 mililitros de tampão de remoção de mielina.

Enquanto as células estão girando, coloque uma coluna para cada amostra no campo magnético de um classificador magnético e coloque um filtro limpo de 80 mícrons no topo de cada coluna. Enxágue cada filtro e coluna com 1 mililitro de tampão de remoção de mielina três vezes, coletando todo o fluxo em um recipiente de resíduos.

Após o enxágue final, coloque tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mililitros diretamente abaixo de cada coluna para coletar o eluato. Em seguida, aspire o sobrenadante das amostras e ressuspenda os pellets em 500 microlitros de tampão de remoção de mielina.

Aplique imediatamente as suspensões de células nas colunas, coletando as células nos tubos abaixo. Em seguida, enxágue cada filtro e coluna 4 vezes com 1 mililitro de tampão de remoção de mielina por lavagem. Após a última lavagem, gire as células e aspire os sobrenadantes.