JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:10 min • July 8th, 2025
Pegue uma suspensão de células obtidas de vermes transgênicos Caenorhabditis elegans em um meio de cultura.
A suspensão contém células de vários tecidos, incluindo neurônios do sistema nervoso.
Os vermes transgênicos foram projetados para expressar uma proteína fluorescente conjugada a um transportador transmembrana vesicular. Este transportador, presente nas vesículas sinápticas que transportam o neurotransmissor acetilcolina, é encontrado em neurônios colinérgicos em todo o corpo.
Centrifugar a suspensão celular e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células em um meio de cultura fresco para classificação de células ativadas por fluorescência, ou FACS.
Analise a suspensão celular usando FACS. Os neurônios colinérgicos marcados com fluorescência emitem fluorescência após exposição à luz de comprimento de onda apropriado, separando-os de outras células não marcadas.
Transfira os neurônios isolados para uma placa de vários poços. Incube as células em uma câmara umidificada para manter o nível de umidade.
Centrifugue as células da suspensão de células isoladas a 10.000 vezes g e a 4 graus Celsius por 5 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em meio suplementado com L-15 até obter uma densidade celular não superior a 6 milhões de células por mililitro, a fim de evitar a sobrecarga do citómetro de fluxo. Em seguida, classifique as células por expressão positiva para GFP usando um citômetro de fluxo capaz de classificar amostras.
As células GFP-negativas podem ser usadas como controle para análises não específicas do tipo de célula. Depois disso, coloque as células isoladas nos poços de uma placa estéril de seis poços. Coloque o prato em um recipiente de plástico. Adicione um lenço umedecido ou lenço de papel macio para adicionar umidade às células e incube a 20 graus Celsius.