Obtenção de fatias de cerebelo de um cérebro embrionário de pintinho

Pegue um ovo de galinha fertilizado em um estágio adequado de desenvolvimento.

Corte a casca para acessar o embrião.

Localize e disseque a cabeça e, em seguida, transfira-a para uma placa de Petri contendo tampão fosfato resfriado.

Remova os olhos e mandíbulas.

Separe a pele da superfície do crânio.

Em seguida, corte e remova os ossos do crânio.

Limpe o tecido conjuntivo circundante para expor o cérebro.

Separe o prosencéfalo.

Em seguida, separe o cerebelo do rombencéfalo e do vaso sanguíneo.

Transfira o cerebelo para um tampão de sal resfriado.

O cerebelo embrionário contém uma camada de células progenitoras neuronais que se dividem rapidamente, o que o torna valioso para estudos de neurogênese.

Coloque o cerebelo na plataforma de um picador de tecidos.

Remova o excesso de tampão e corte o cerebelo.

Coloque tampão de sal gelado nas fatias.

Transfira as fatias de cerebelo para uma placa de Petri contendo tampão de sal resfriado.

Sob um microscópio, separe as fatias individuais para análise posterior.

Para começar, coloque os ovos de galinha marrons fertilizados em uma incubadora de ovos a 38 graus Celsius até atingirem o dia embrionário 14. No dia embrionário 14, corte uma abertura no ovo para expor o embrião e decapite o embrião do pintinho no ovo. Coloque a cabeça em uma placa de Petri contendo PBS gelado.

Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça padrão para fazer uma incisão atrás de cada olho, em todo o tecido e remover os olhos e a mandíbula superior. Em seguida, faça uma segunda incisão em toda a faringe para remover a mandíbula inferior. Em seguida, use uma pinça padrão para remover a pele da superfície do crânio, retirando-a. Em seguida, remova os ossos frontal e parietal, revelando o cérebro.

Do ponto de vista ventral, remova a cartilagem faríngea e o mesênquima auxiliar. Em seguida, coloque o cérebro, com o lado dorsal para cima e remova cuidadosamente o mesênquima, dorsal ao rombencéfalo, tomando cuidado para não danificar o pia. Em seguida, faça uma incisão em todo o tecido entre o mesencéfalo e o rombencéfalo para separar o rombencéfalo, incluindo o cerebelo. Faça incisões em todo o tecido nas junções laterais do cerebelo e na placa alar do rombencéfalo. Remova todo o cerebelo, tomando cuidado para manter a integridade da pia durante toda a dissecção.

Finalmente, remova o plexo coróide em formação e mova o cerebelo dissecado para HBSS gelado. Transfira todo o cerebelo para a plataforma estéril de um picador de tecidos, usando uma espátula ou uma pipeta Pasteur de 3 mililitros com a ponta cortada para ampliar a abertura. Remova o excesso de líquido usando uma pipeta.

Defina a velocidade de corte do picador de tecidos para 50% de seu valor máximo. Em seguida, corte o cerebelo na orientação desejada com uma espessura de 300 micrômetros. Usando uma pipeta Pasteur de 3 mililitros, cubra o cerebelo fatiado em HBSS frio.

Em seguida, transfira o HBSS e as fatias para uma placa de Petri de 60 milímetros contendo 20 mililitros de HBSS gelado, usando a pipeta Pasteur de 3 mililitros com a ponta cortada. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecação, iluminado com uma fonte de luz de fibra óptica. Em seguida, use uma pinça de relojoeiro para separar fatias individuais de tecido cerebral.