JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 5:29 min • July 8th, 2025
Colha a medula espinhal do rato e corte-a em fragmentos.
Transferir os fragmentos para um tubo contendo uma enzima proteolítica e DNase. Vórtice e incubar.
A enzima digere a matriz extracelular do tecido, enquanto a DNase degrada o DNA livre contaminante.
Vortex novamente e pipeta repetidamente para completar a dissociação do tecido, obtendo uma suspensão unicelular.
Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células em uma solução contendo DNase e um inibidor de protease e vórtice. O inibidor neutraliza a enzima.
Coloque uma solução inibidora fresca por cima, centrifugue e remova o sobrenadante.
Ressuspenda as células em meios de gradiente de densidade, vórtice e, em seguida, centrifugue.
As células se depositam na parte inferior, enquanto os detritos de mielina permanecem na parte superior.
Descarte os detritos. Lave repetidamente com tampão, centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células em meios de crescimento.
Coloque as células em placas. A superfície não revestida facilita a fixação das células gliais.
Remova o meio gasto e adicione meio fresco para induzir a proliferação de células gliais, estabelecendo uma cultura glial mista.
Trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, transfira quatro medulas espinhais de camundongos para uma placa de Petri de HBSS. Use tesouras e fórceps estéreis para cortar cada uma das medulas espinhais em pedaços pequenos. Em seguida, transfira os pedaços para um tubo cônico de 50 mililitros contendo a mistura da enzima papaína DNase. Evite transferir HBSS para a mistura enzimática, pois isso pode resultar em diminuição do desempenho da enzima.
É crucial que os pedaços de tecido sejam bem digeridos para obter uma suspensão unicelular. No entanto, a digestão excessiva resultará em menos células viáveis. Cada laboratório precisa realizar testes piloto para determinar o tempo exato de digestão com base no que funciona melhor para suas células.
Em seguida, subtraia suavemente o tubo e incube a 37 graus Celsius por uma hora com agitação orbital a 150 rotações por minuto. Após a incubação, vórtice o tubo e, em seguida, triture vigorosamente o tecido usando uma pipeta de 5 mililitros para promover uma maior dissociação. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 300 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente.
Durante a centrifugação, adicione 300 microlitros de solução inibidora de albumina ovomucóide reconstituída a 2,7 mililitros de EBSS em um tubo estéril e misture bem. Em seguida, adicione 150 microlitros de solução DNase. Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular no inibidor de albumina ovomucóide e na solução de DNase recentemente preparados. Vórtice bem para quebrar o pellet celular.
Em seguida, adicione 3 mililitros de solução inibidora de albumina ovomucóide reconstituída sem DNase à suspensão celular. Centrifugar as células a 70 vezes g durante 6 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, remover o sobrenadante que contém fragmentos de membrana e reter o sedimento.
Para remover a mielina das células dissociadas da medula espinhal, primeiro adicione 8 mililitros de meio de gradiente de densidade de 20% à temperatura ambiente no tubo que contém o pellet celular e o vórtice suavemente. Em seguida, centrifugue as células a 800 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente sem quebrar. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente a camada superior de detritos, que contém principalmente mielina, e o sobrenadante que sai do pellet.
Para remover qualquer gradiente de densidade remanescente, lave as células ressuspendendo o pellet com 8 mililitros de cDMEM diluído com HBSS. Centrifugue as células a 400 g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e lave as células com cDMEM diluído como antes.
Após a remoção do sobrenadante, o pellet pode ser armazenado no gelo até a semeadura das células. Quando estiver pronto para o plaqueamento, ressuspenda as células em 14 mililitros de cDMEM suplementado com 2-mercaptoetanol e adicione 1 mililitro da suspensão celular a cada poço em uma placa de 12 poços.
Placa de poços extras que podem ser usados para determinar o número médio de células por poço e o conteúdo microglial da cultura. Uma vez que as células tenham sido plaqueadas, incube as células a 35,9 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque o meio no dia 1, que é o dia seguinte ao revestimento.
Algumas células estão presas à placa de cultura, mas ainda são em sua maioria redondas. Existem também muitas células flutuantes e detritos significativos. Repita a mudança de mídia três a quatro dias depois.