Diferenciando progenitores óticos multipotentes imortalizados em neurônios ganglionares espirais e avaliando a diferenciação

Pegue uma placa de vários poços contendo lamínulas estéreis revestidas com um substrato de cultura de células.

Introduza progenitores óticos multipotentes imortalizados, ou iMOPs, em um meio de diferenciação neuronal.

Os iMOPs são precursores de várias células do ouvido interno, incluindo neurônios ganglionares espirais, ou SGNs, que transmitem informações auditivas ao cérebro.

Incubar, permitindo que as células adiram ao substrato. O meio induz a diferenciação dos iMOPs em SGNs.

Adicione um fixador para induzir a reticulação de proteínas, preservando a morfologia celular, e uma solução detergente para permeabilizar as membranas celulares.

Introduzir um reagente de bloqueio para evitar a rotulagem não específica.

Adicione anticorpos conjugados com fluoróforo específicos para marcadores de diferenciação neuronal e incuba, permitindo que os anticorpos rotulem os SGNs.

Lave para remover anticorpos não ligados e monte as lamínulas com um meio de montagem contendo uma mancha nuclear fluorescente.

Usando microscopia de fluorescência, detecte os sinais de anticorpos para confirmar a diferenciação de iMOPs em SGNs.

Primeiro, limpe as lamínulas de vidro redondas, colocando-as em uma placa estéril de 100 milímetros e submergindo-as em etanol a 70%. Agite suavemente as lamínulas para garantir que estejam cobertas e deixe o prato em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, enxágue as lamínulas três vezes em 1x PBS estéril e depois uma vez com água estéril.

Em seguida, deixe as lamínulas secarem, expondo-as à luz ultravioleta em uma capa de cultura de tecidos por 15 minutos. Para uso imediato, coloque uma lamínula estéril em cada poço de uma placa de 24 poços e agite suavemente a placa para garantir que todas as lamínulas fiquem planas. Em seguida, cubra as lamínulas adicionando 0,25 mililitros de 1x PBS contendo 10 microgramas por mililitro de poli-D-lisina a cada poço.

Após a placa ter incubado por uma hora a 37 graus Celsius, remova a solução de poli-D-lisina e lave os poços três vezes com PBS 1x estéril. Uma vez aspirado o líquido da última lavagem, introduza 0,25 mililitros de 1x PBS contendo 10 microgramas por mililitro de laminina em cada um dos 24 poços. Depois de incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius, aspirar a solução de laminina. Em seguida, lave cada poço com 1 mililitro de 1x PBS três vezes, mas deixe o PBS da última lavagem nos poços até que as células estejam prontas para serem plaqueadas.

Para iniciar a diferenciação neuronal, conte as células das otosferas dissociadas conforme descrito anteriormente e, em seguida, ressuspenda-as em meio de diferenciação neuronal pré-aquecido. Proceda semeando entre 1 e 1,5 x 10⁵ células iMOP em cada poço da placa que contém as lamínulas revestidas. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, substituindo o meio de diferenciação neuronal em dias alternados.

Após sete dias, aspirar o meio e fixar as células, que devem ser fixadas às lamínulas, adicionando formaldeído a 4% em cada poço e deixando-as por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o formaldeído e lave as células uma vez em 1x PBS contendo 0,1% de Triton X-100. Em seguida, remova o tampão de lavagem e adicione tampão de bloqueio consistindo em 1x PBS contendo 10% de soro de cabra normal e 0,1% de Triton X-100 em cada poço.

Deixar as células durante uma hora à temperatura ambiente e, em seguida, remover o líquido e substituí-lo por tampão de bloqueio contendo a diluição adequada do anticorpo Cdkn1b ou Tubb3. Após uma incubação noturna a 4 graus Celsius, lave as células uma vez com 1x PBS contendo 1% de Triton X-100 e, em seguida, prossiga com a imunocoloração conforme descrito anteriormente. Após a conclusão da coloração, faça uma lavagem final adicionando 1x PBS aos poços.

Para prepará-los para análise, remova as lamínulas às quais as células de mancha estão presas da placa de 24 poços e coloque-as no meio de montagem em uma lâmina de vidro. Depois de deixar o meio de montagem secar durante a noite a 4 graus Celsius, adquira imagens de epifluorescência conforme descrito anteriormente.