JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:15 min • July 8th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou iPSCs, em um meio com um inibidor de Rho-quinase, que promove a sobrevivência celular.
Substitua o meio por um meio essencial contendo nutrientes e fatores de crescimento.
Incubar para permitir a proliferação e diferenciação de iPSCs em células precursoras.
Substitua este meio por um meio de diferenciação suplementado com fatores de crescimento de fibroblastos e ácido retinóico e, em seguida, incube.
Os fatores de crescimento facilitam a diferenciação de células precursoras em células endoteliais microvasculares, enquanto o ácido retinóico promove a síntese de proteínas de junção apertada.
Lave e trate as células com uma solução enzimática-EDTA para separar as células, criando uma suspensão unicelular.
Centrifugue para coletar as células e remover o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em um novo meio de diferenciação.
Semeie esta suspensão celular em uma placa de vários poços revestida com colágeno e proteínas de adesão.
Incubar para permitir a adesão celular, formando junções apertadas entre as células, assemelhando-se às células endoteliais microvasculares cerebrais.
Para induzir a diferenciação de BMEC de iPSCs humanas, lave a cultura de iPSC confluente com DPBS uma vez antes de incubar as células com o volume apropriado de EDTA enzimático por aproximadamente cinco minutos a 37 graus Celsius.
Quando uma suspensão de célula única for obtida, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em um volume apropriado de meio de células-tronco, suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar para contagem.
Dilua as células a uma concentração de 1,56 vezes 10 elevado ao quarto centímetro cúbico de células e semeie 2 mililitros de células em poços individuais de fundo plano de 6 poços. Após 24 horas na incubadora de cultura de células, substituir o sobrenadante em cada alvéolo por meio E6 e voltar a colocar a placa na incubadora durante mais quatro dias.
Para purificar os BMECs derivados de iPSC, cubra as placas de subcultura com o volume apropriado de uma solução de colágeno IV e fibronectina recém-preparada por poço e incube as placas por um mínimo de duas horas a 37 graus Celsius.
No dia 6 de diferenciação, colete as células por centrifugação e ressuspenda os pellets no volume apropriado de meio fresco livre de soro endotelial humano suplementado com B27, fator de crescimento básico de fibroblastos e ácido retinóico. Coloque as células em cada poço de uma placa de fundo plano de 24 poços revestida com colágeno e fibronectina.