Gerando um chip de barreira hematoencefálica usando células precursoras derivadas de iPSC

Pegue um chip microfluídico com canais sobrepostos e revestidos de matriz separados por uma membrana porosa.

Semeie células progenitoras neurais derivadas de iPSC no canal superior. Incube para aderência celular e, em seguida, lave para remover as células soltas.

Em seguida, semeie células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas de iPSC no canal inferior.

Inverta o chip e incube-o para prender as células endoteliais ao lado da membrana do canal inferior.

Em seguida, vire o chip para prender as células ao lado inferior do canal, formando uma estrutura semelhante a um tubo de monocamada. Lave ambos os canais com mídia específica para células.

Flui continuamente um meio de diferenciação neural no canal superior e um meio de células endoteliais no canal inferior.

As células endoteliais utilizam fatores de crescimento do meio para amadurecer e formam junções apertadas semelhantes a um vaso sanguíneo, formando o lado do sangue.

Fatores neurotróficos impulsionam a diferenciação de células progenitoras neurais em várias células cerebrais, formando o lado cerebral. Essas células interagem com as células endoteliais, criando uma barreira hematoencefálica no chip.

Para começar, leve o prato contendo as batatas fritas preparadas para o armário de biossegurança. Usando uma pipeta P200, lave suavemente os dois canais adicionando 200 microlitros de meio de diferenciação neural na entrada e puxando o líquido da saída. Evitando o contato com as portas, aspire cuidadosamente o excesso de gotículas de mídia da superfície do chip.

Agite suavemente a suspensão celular para garantir uma suspensão celular homogênea. Para semear as células progenitoras neurais derivadas de iPSC no canal superior para gerar o lado do cérebro, adicione uma ponta P200 contendo 30 a 100 microlitros de suspensão celular na concentração de 1 x 10⁶ células por mililitro na entrada do canal superior e solte suavemente a ponta da pipeta.

Pegue uma pipeta P200 vazia para pressionar o êmbolo, insira na saída do canal superior e puxe cuidadosamente a suspensão de célula única pela ponta. Transfira o chip para o microscópio para verificar a densidade de semeadura na distribuição homogênea das células dentro do canal superior. Depois de confirmar a densidade celular com 20% de cobertura, coloque imediatamente os chips na incubadora por duas horas a 37 graus Celsius.

Depois disso, lave as células que não se ligam adicionando um novo meio de diferenciação neural na entrada e acumulando o líquido por uma pipeta da saída. Mantenha as células em condições estáticas a 37 graus Celsius com uma substituição diária do meio de diferenciação neural. Após a fixação dos iNPCs ou em um dia subsequente após a semeadura, leve o prato contendo os chips preparados para o gabinete de biossegurança. Lave suavemente o canal inferior com 200 microlitros de meio de células endoteliais.

Evitando o contato com as portas, aspire cuidadosamente gotículas do excesso de meio de células endoteliais da superfície do chip, certificando-se de deixar o meio em ambos os canais. Agite suavemente a suspensão celular para garantir uma suspensão celular homogênea. Usando uma pipeta P200, retire 30 a 100 microlitros da suspensão de células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas de iPSC na concentração de 14 a 20 x 10⁶ células por mililitro e coloque a ponta na entrada do canal inferior.

O passo mais crítico para alcançar propriedades de barreira funcional é a semeadura de células endoteliais microvasculares cerebrais. É crucial semear células na densidade adequada para evitar a formação de bolhas para verificar a distribuição homogênea dentro da bainha do órgão.

Pressione o êmbolo em uma pipeta P200 com a ponta vazia, insira na saída do canal inferior e solte lentamente o êmbolo da pipeta para puxar cuidadosamente a suspensão de célula única pelo canal inferior. Aspire o excesso de suspensão celular da superfície do chip. Evite o contato direto com as portas de entrada e saída para garantir que nenhuma suspensão de célula seja aspirada para fora dos canais. Transfira o chip para o microscópio para verificar a densidade de semeadura.

O canal inferior é preenchido com células sem lacunas observáveis entre elas. Depois de confirmar a densidade celular correta, semeie as células nos chips restantes. Para prender as células na membrana porosa, localizada na parte superior do canal inferior, inverta cada chip e deixe-as descansar em um berço de chip. Coloque um pequeno reservatório contendo DPBS estéril dentro do prato de 150 milímetros para fornecer umidade para as células.

Incube os chips a 37 graus Celsius por aproximadamente três horas ou até que as células no canal inferior se fixem. Depois que as células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas de iPSC estiverem ligadas, vire os chips de volta para a posição vertical para permitir a fixação das células na parte inferior do canal inferior. 48 horas após a semeadura das células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas de iPSC, equilibram a temperatura do meio celular endotelial aquecendo em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, desgaseifique o meio por incubação sob um sistema de filtragem acionado a vácuo por 15 minutos. Em seguida, higienize o exterior da embalagem e das bandejas do módulo portátil com etanol a 70%, limpe e transfira-os para o gabinete de biossegurança. Abra a embalagem e coloque os módulos na bandeja. Oriente-os com os reservatórios na parte de trás da bandeja. Pipete 3 mililitros do meio quente pré-equilibrado para cada reservatório de entrada. Adicione o meio de cultura de células endoteliais ao reservatório de entrada do canal inferior e o meio de diferenciação neural ao reservatório de entrada do canal superior do canal superior.

Em seguida, pipete 300 microlitros do meio quente pré-equilibrado para cada reservatório de saída diretamente sobre cada porta de saída. Coloque até 6 módulos portáteis em cada bandeja. Traga as bandejas para a incubadora e deslize completamente para dentro do módulo de cultura com a alça da bandeja voltada para fora. Selecione e execute o ciclo principal no módulo de cultura. Feche a porta da incubadora e deixe o módulo de cultura preparar os módulos portáteis por cerca de um minuto.

O ciclo de preparação é concluído quando a barra de status exibe "Pronto". Retire a bandeja do módulo de cultura e leve-a ao gabinete de biossegurança. Inspecione a parte inferior de cada módulo portátil no gabinete de biossegurança para verificar se os módulos portáteis foram preparados com sucesso. Procure a presença de pequenas gotículas em todas as quatro portas. Se algum módulo portátil não mostrar gotículas, execute novamente o ciclo principal nesses módulos. Se algum meio pingar na bandeja, o que ocorre com mais frequência pelas portas de saída, limpe a bandeja com etanol 70%.

Em seguida, lave suavemente os dois canais de cada chip com meio de cultura específico para células quentes e equilibradas para remover possíveis bolhas no canal e coloque pequenas gotículas de meio na parte superior de cada porta de entrada e saída. Insira os chips com suportes nos módulos portáteis e coloque até seis em cada bandeja. Insira as bandejas no módulo de cultura. Programe as condições apropriadas de cultura de chips de órgãos, como taxa de fluxo e alongamento no módulo de cultura. Assim que o ciclo de regulação estiver concluído, o que leva aproximadamente duas horas, as condições programadas são iniciadas. Depois disso, o módulo de cultura começa a fluir nas condições predefinidas de cultura de chips de órgãos.