Estabelecendo uma cultura de células de gânglios da raiz dorsal primária a partir de uma coluna vertebral de rato

Pegue uma coluna vertebral de rato. Faça dois cortes nas laterais e um corte lateral.

Remova os músculos dorsais e a porção dorsal das vértebras.

Extraia a medula espinhal.

Identifique os gânglios da raiz dorsal, ou DRGs, localizados bilateralmente ao longo das vértebras lombares.

Os DRGs contêm neurônios cercados por células gliais.

Extirpe os DRGs e colete-os em um prato. Lave o lenço repetidamente com meios sem soro.

Transfira os DRGs para uma placa contendo solução de colagenase e incuba. A colagenase degrada a matriz extracelular.

Lave com tampão. Adicione tripsina-EDTA e incube para interromper as junções célula-célula, afrouxando as células.

Transfira os DRGs para um tubo, centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o tecido em meios de cultura e pipete repetidamente para liberar as células.

Transfira as células para uma placa de cultura revestida de polímero para facilitar a fixação.

Remova o meio e adicione um novo meio contendo inibidores e fatores de crescimento.

Os inibidores limitam a proliferação de células gliais, enquanto os fatores de crescimento promovem o crescimento neuronal.

Colete os gânglios da raiz dorsal lombar do tronco de um rato de duas a três semanas de idade. Comece fazendo dois cortes ao longo dos lados da coluna vertebral e um corte lateral para marcar a extensão rostral da coluna lombar. Em seguida, use uma pinça de corte ósseo para remover os músculos dorsais da coluna. Em seguida, remova a porção dorsal das vértebras e exponha a medula espinhal, depois use uma tesoura de dissecção e uma pinça para remover a medula espinhal.

Identifique o DRG lombar contando as vértebras da última costela. Este diagrama mostra as posições das vértebras. Use microtesouras para coletar os 12 DRG lombares bilaterais de L1 a L6. Remova todas as fibras neuronais ligadas para melhorar a pureza da cultura. Transfira cada DRG lombar para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo 2 mililitros de meio sem soro gelado.

Transfira o prato de 35 milímetros contendo DRG para uma capela laminar e lave o DRG com meio sem soro três vezes com pipeta. Use uma pinça estéril para mover os DRGs para uma nova placa de cultura de 35 milímetros contendo 2 mililitros de colagenase estéril tipo 1A. Coloque o tecido em solução de colagenase na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por 30 minutos para iniciar a dissociação das células.

Após a incubação, remova a solução de colagenase e lave o DRG três vezes em 2 mililitros de solução salina balanceada de Hank. Em seguida, adicione 2 mililitros de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido ao prato e digerir o DRG na incubadora por 30 minutos como antes. Após a digestão, use uma pipeta de vidro para transferir os 2 mililitros de solução contendo DRG para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

O DRG pode grudar na pipeta de vidro, portanto, esta etapa deve ser realizada com cuidado. A perda de DRG pode ser evitada mantendo a solução contendo DRG na extremidade cônica da pipeta de vidro e transferindo a solução para o tubo de centrífuga lentamente, mas sem pausa.

Em seguida, centrifugue a solução a 290 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e adicione mais 2 mililitros de meio sem soro para ressuspender o DRG. Repita a lavagem duas vezes usando 2 mililitros de meio de cultura pré-aquecido para ressuspender o tecido após a centrifugação final.

Use a pipeta estéril polida por chama previamente preparada para triturar manualmente o DRG aproximadamente 60 vezes. Em seguida, remova uma placa de 24 poços revestida com poli-L-lisina contendo 1 mililitro de meio de cultura por poço da incubadora de CO2. Aspirar o meio de cultura incubado da placa.

Semeie as células DRG de um rato em quatro dos poços. Isso dá uma densidade de semeadura de aproximadamente 500.000 células por poço. No dia seguinte, substituir o meio de cultura por um meio suplementado com 10 AraC micromolares e 100 nanogramas por mililitro de NGF.