Infectando neurônios primários do mesencéfalo de camundongos com vírus adeno-associados projetados

Comece com uma cultura de células do mesencéfalo de camundongo embrionário em uma lamínula.

Trate com vírus adeno-associados projetados que codificam um complexo indicador de cálcio fluorescente sob um promotor específico de neurônio.

Incubar para fixação viral e internalização.

Remova o meio para eliminar os vírus não ligados, adicione um meio de cultura e incuba.

Os vírus internalizados liberam seu genoma no núcleo, onde o promotor específico do neurônio impulsiona a produção de complexos indicadores de cálcio exclusivamente nos neurônios primários.

Esses complexos incluem uma proteína fluorescente marcada com uma proteína de ligação ao cálcio e um peptídeo M13.

Transfira a lamínula para um prato com um tampão de gravação rico em íons de cálcio e, em seguida, coloque-a em uma câmara de gravação para imagens confocais ao vivo.

Introduza um tampão de registro de glutamato, fazendo com que o glutamato se ligue aos canais iônicos, levando à entrada de íons de cálcio.

Esses íons se ligam ao complexo, causando uma mudança conformacional e emissão de fluorescência.

Na imagem ao vivo, os neurônios brilhantes indicam a infecção viral.

Comece preparando 1 mililitro de meio DMEM sem soro co