Infectando neurônios primários do mesencéfalo de camundongos com vírus adeno-associados projetados

Comece com uma cultura de células do mesencéfalo de camundongo embrionário em uma lamínula.

Trate com vírus adeno-associados projetados que codificam um complexo indicador de cálcio fluorescente sob um promotor específico de neurônio.

Incubar para fixação viral e internalização.

Remova o meio para eliminar os vírus não ligados, adicione um meio de cultura e incuba.

Os vírus internalizados liberam seu genoma no núcleo, onde o promotor específico do neurônio impulsiona a produção de complexos indicadores de cálcio exclusivamente nos neurônios primários.

Esses complexos incluem uma proteína fluorescente marcada com uma proteína de ligação ao cálcio e um peptídeo M13.

Transfira a lamínula para um prato com um tampão de gravação rico em íons de cálcio e, em seguida, coloque-a em uma câmara de gravação para imagens confocais ao vivo.

Introduza um tampão de registro de glutamato, fazendo com que o glutamato se ligue aos canais iônicos, levando à entrada de íons de cálcio.

Esses íons se ligam ao complexo, causando uma mudança conformacional e emissão de fluorescência.

Na imagem ao vivo, os neurônios brilhantes indicam a infecção viral.

Comece preparando 1 mililitro de meio DMEM sem soro com 1 microlitro de hSyn-GCaMP6f AAV por prato. Aspirar o meio de cultura celular de cada placa e substituí-lo por 1 mililitro do DMEM preparado com hSyn-GCaMP6f. Coloque os pratos de volta na incubadora de 37 graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, aspire o meio com AAVs e substitua-o por 3 mililitros de meio de cultura celular. Incube os pratos a 37 graus Celsius por cinco a sete dias, trocando o meio a cada dois ou três dias durante esse período de infecção viral.

Prepare 1 litro do tampão de registro HEPES, 200 mililitros de tampão de registro de glutamato 20 micromolar e 200 mililitros de tampão de registro NBQX 10 micromolar, de acordo com as instruções do manuscrito.

Encha uma placa de Petri estéril de 35 milímetros com 3 mililitros do tampão de registro. Pegue a placa de Petri com as culturas infectadas da incubadora. Em seguida, pegue cuidadosamente a borda de uma lamínula com uma pinça de ponta fina e transfira-a para o prato com o buffer de gravação.

Coloque a lamínula restante no meio de volta na incubadora de 37 graus Celsius e transporte o prato com tampão de gravação para o microscópio confocal. Inicie o software de imagem. Enquanto estiver inicializando, inicie a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação. Em seguida, calibre o fluxo para 2 mililitros por minuto.

Transfira a lamínula infectada da placa de Petri para o banho de registro com uma pinça fina. Usando a objetiva de imersão em água de 10x e a luz de campo claro, encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares de neurônios. Em seguida, mude para a objetiva de 40x e reoriente a amostra.

Selecione e aplique AlexaFluor 488 na janela da lista de corantes. Para evitar a superexposição e o fotobranqueamento dos fluoróforos, comece com configurações baixas de HV e potência do laser.

Para o canal AlexaFluor 488, defina o HV para 500, o ganho para 1x e o deslocamento para 0. Defina a potência para 5% para a linha de laser 488. Aumente o tamanho do orifício para 300 micrômetros e use a opção de varredura "foco x2" para ajustar de maneira ideal os sinais de emissão aos níveis de subsaturação. As configurações podem ser ajustadas para visibilidade ideal de cada canal.

Depois que as configurações do microscópio estiverem otimizadas, mova a platina para localizar uma região com várias células exibindo alterações espontâneas na fluorescência do GCaMP6f e concentre-se no plano desejado para a imagem.

Use a ferramenta "Recortar reto" para recortar o quadro de imagem em um tamanho que possa atingir um intervalo de quadros de pouco menos de um segundo. Defina a janela de intervalo como um valor de 1,0 e a janela num como 600.

Para capturar um filme da série T, selecione a opção "Tempo". Em seguida, use a opção de digitalização "XYt" para iniciar a geração de imagens. Observe a barra de progresso da imagem e mova a linha do buffer de registro HEPES para o buffer de registro de glutamato de 20 micromolares no ponto de tempo apropriado.

Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão "série concluída" e salve o filme da série t finalizado. Continue a perfundir o glutamato por mais 5 minutos para que os neurônios cultivados tenham sido expostos ao glutamato por um total de 10 minutos. Repita esse processo para cada lamínula a ser fotografada.