Preparando fatias de córtex rinal-hipocampo de um cérebro de filhote de rato

Pegue um cérebro de filhote de rato recém-colhido, com o lado dorsal para cima, em uma placa de cultura com tampão resfriado.

Abra os hemisférios cerebrais e remova os tecidos que cobrem o hipocampo.

Incisar os hemisférios de modo que contenham o hipocampo e os córtices rinais.

Coloque os dois hemisférios com os hipocampos voltados para cima e paralelos em um papel de filtro.

Transfira este conjunto para um picador de tecidos com a lâmina perpendicular aos hemisférios.

Corte os hemisférios na espessura necessária para obter fatias e transfira-as para uma placa de cultura com tampão resfriado.

Separe cuidadosamente as fatias e disseque-as para incluir regiões do hipocampo e do córtex rinal estruturalmente intactas.

Transfira as fatias para inserções membranosas em uma placa de vários poços contendo meio.

Remova o excesso de tampão das fatias e incube-as para recuperação do tecido.

Atualize a mídia. As fatias podem ser usadas para análise posterior.

Transfira o cérebro, com o lado dorsal para cima, para uma placa de 60 milímetros contendo 5 mililitros de GBSS frio. Insira uma pinça fina no cerebelo e insira a espátula ao longo da linha média para abrir cuidadosamente o hemisfério. Use uma pinça curta e curva para remover cuidadosamente o excesso de tecido que cobre o hipocampo sem tocar na estrutura do hipocampo. Em seguida, corte abaixo de cada hipocampo.

Transfira um hemisfério de cada vez, com o lado do hipocampo para cima e paralelo um ao outro, para um pedaço de papel de filtro. Coloque o papel de filtro em um picador de lenços de papel com os hemisférios perpendiculares à lâmina e corte os hemisférios em fatias de 350 mícrons. Transfira o tecido fatiado para uma nova placa de Petri contendo 5 mililitros de GBSS frio e use eletrodos de ponta redonda para separar cuidadosamente as fatias.

Mantendo apenas as amostras com córtex rinal e hipocampo estruturalmente intactos, use uma espátula e um eletrodo de ponta redonda para colocar até quatro fatias intactas em inserções individuais no número apropriado de poços de uma placa de seis poços contendo 1,1 mililitros de meio de cultura por poço.

Use uma pipeta P20 para remover qualquer excesso de meio de dissecção ao redor de cada fatia. Coloque a placa na incubadora de cultura de células. Troque o meio a cada dois ou três dias. Use uma pinça para levantar a inserção. Aspire o meio do poço correspondente e coloque o inserto de volta no lugar. Use uma pipeta P1000 para adicionar 1 mililitro de meio fresco a 37 graus Celsius a cada poço.