Isolando neurônios sensoriais e co-cultivando com células assassinas naturais

Pegue um gânglio da raiz dorsal ou DRG, um aglomerado de neurônios sensoriais, em um meio frio contendo soro para proteger os neurônios durante o processamento subsequente.

Centrifugue e remova o sobrenadante.

Adicione um tampão fosfato contendo enzimas digestivas e incube com agitação leve.

As enzimas dissociam a matriz extracelular, ou MEC, e o tecido DRG, soltando as células.

Adicione um meio contendo soro para inativar as enzimas.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspender o DRG e dissociar mecanicamente o tecido usando pipetas de tamanhos progressivamente menores para obter uma suspensão celular.

Coloque as células em camadas sobre um gradiente de densidade de albumina sérica bovina.

centrifuga. Os neurônios se acomodam no fundo, formando uma pelota.

Descarte as camadas que contêm detritos de tecido.

Ressuspenda os neurônios em um meio de cultura.

Adicione os neurônios a uma placa de cultura revestida com ECM e incuba.

Remova o meio e adicione células natural killer ou NK.

Adicione um meio à co-cultura e estude a interação entre essas células.

Colha os DRGs em um tubo cônico de 15 mililitros cheio de 10 mililitros de DMEM suplementado gelado. Em seguida, centrifugue a preparação por 5 minutos a 200 g em temperatura ambiente e remova o sobrenadante. Adicione 250 microlitros de PBS contendo 1 miligrama por mililitro de colagenase IV e 2,4 unidades por mililitro Dispase também. Incube este DRG com solução de dispersão de colagenase por 80 minutos com agitação leve.

Para inativar as enzimas, adicione 5 mililitros de meio DMEM suplementado e centrifugue a solução a 200 g. Após 5 minutos, remova suavemente o sobrenadante usando uma pipeta e deixe cerca de 100 microlitros do sobrenadante para evitar perda celular indesejada. Em seguida, adicione 1 mililitro de DMEM suplementado nas células e use uma pistola de pipeta e três pipetas de vidro Pasteur de tamanhos decrescentes para triturar suavemente o DRG em uma preparação de célula única.

Usando uma pipeta P200, adicione a suspensão de gânglios triturados contendo os neurônios na lateral do tubo no gradiente BSA. Em seguida, defina a aceleração e a desaceleração no mínimo para centrifugar o neurônio que contém o gradiente BSA por 12 minutos a 200 g. Após a centrifugação, remova todo o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda as células em 500 microlitros de neurobasal.

Placa de 10.000 neurônios por poço em uma placa de 96 poços de fundo plano revestida com laminina. Para permitir a fixação dos neurônios, incube a placa de 96 poços durante a noite a 37 graus Celsius. Para iniciar a co-cultura, remova lentamente o neurobasal da cultura de neurônios e adicione 10⁵ células NK por poço à cultura de neurônios.