Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:52 min. • July 8th, 2025
Comece com um poço contendo células progenitoras neurais ou agregados NPC na diferenciação de meio-1 ou DM-1.
Esses NPCs são precursores da linhagem neural gerada a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou hiPSCs usando DM-1 sob condições controladas.
Transfira os agregados NPC para um inserto de membrana colocado dentro de um poço contendo DM-1 e remova o excesso de mídia.
Mude o meio para DM-2 e incuba.
O DM-2 fornece nutrientes e fatores de diferenciação que promovem a maturação de NPCs em diferentes tipos de células neurais.
NPCs indiferenciados se transformam em corpos embrióides, conhecidos como corpos embrióides sem soro ou SFEBs, pois a mídia não possui soro. Esses EBs se assemelham à morfologia de um cérebro em desenvolvimento.
Transfira o inserto para um poço contendo DM-3.
O DM-3 contém fatores de crescimento essenciais para a manutenção e crescimento dos SFEBs.
Incubar até que os SFEBs atinjam o tamanho desejado.
Após duas semanas de cultura das células, prepare placas de seis poços com inserções de cultura de células de 40 mícrons e 1 mililitro de meio DM1. Incube essas placas por pelo menos quatro horas antes de adicionar as células cultivadas.
Em seguida, usando uma ponta de pipeta de boca larga de 200 microlitros, colete agregados de células de duas semanas com cerca de 20 microlitros de meio. Transfira de quatro a seis agregados para cada inserto com solução mínima. Remova qualquer excesso.
Durante esta etapa, é importante trabalhar rapidamente e com mão firme. Ao remover o meio ao redor dos SFEBs, você pode ver os SFEBs se moverem pela solução devido à tensão superficial. Não há problema em reposicioná-los depois que o meio for removido.
Depois que todos os agregados estiverem carregados nas inserções, troque o meio para 1 mililitro de DM2 e continue cultivando as células. A cada dois dias, substitua 3/4 do meio por meio fresco. Após 14 dias de cultivo, comece a adicionar o meio DM3 às culturas. Continue a cultura por mais 16 dias para aumentar os SFEBs.