Gerando um modelo de co-cultura 3D de fibroblastos e neurônios da córnea humana

Pegue os fibroblastos da córnea humana.

Transfira-os para uma inserção de membrana dentro de uma placa de vários poços contendo meio.

Adicione mídia à inserção da membrana. Incube para aderência de fibroblastos à inserção.

Em seguida, substitua o meio por meio contendo vitamina C no inserto da membrana e no reservatório.

incubar. A vitamina C estimula os fibroblastos a secretar e montar uma matriz extracelular 3D.

Adicione uma suspensão de células de neuroblastoma humano sobre os fibroblastos.

Incubar, permitindo a adesão de células de neuroblastoma.

Agora, adicione meios contendo ácido retinóico sobre as células e complemente o reservatório com meios frescos.

incubar. O ácido retinóico desencadeia a diferenciação celular do neuroblastoma em células progenitoras neurais.

Em seguida, remova a mídia. Introduza meios frescos no reservatório. Adicione meios contendo um fator neurotrófico à inserção da membrana e incuba.

Fatores neurotróficos desencadeiam a diferenciação de células progenitoras em neurônios, gerando um modelo de co-cultura 3D de fibroblastos e neurônios da córnea humana.

Para montar construções 3D, primeiro, passe e conte os fibroblastos da córnea humana. Em seguida, semeie aproximadamente 1 vezes 10 elevado a 6 HCFs em uma inserção de membrana de policarbonato com poros de 0,4 mícron. Adicione 1,5 mililitros de meio fresco ao topo da construção. Em seguida, pipete mais 1,5 mililitros do mesmo meio para a parte inferior de cada construção.

Após 24 horas, adicione 1,5 mililitros de meio suplementado com 0,5 milimolar de vitamina C na parte superior e inferior de cada construção. Incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por três semanas, adicionando meios frescos contendo vitamina C em dias alternados. Isso estimulará as células a secretar e montar sua própria matriz extracelular. Após três semanas, adicione 8 vezes 10 às 3 células de neuroblastoma humano SH-SY5Y no topo das construções 3D montadas anteriormente.

É fundamental calcular o número exato de células nesta etapa e aguardar 24 horas antes de iniciar a diferenciação celular.

Após 24 horas de incubação, inicie a diferenciação celular SH-SY5Y estimulando as células com 1,5 mililitros de EMEM com 10% de FBS e 10 micromolares de ácido retinóico. Em seguida, adicione 1,5 mililitros do meio contendo vitamina C na parte inferior da construção. O ácido retinóico é sensível à luz, portanto, esta etapa deve ser realizada no escuro.

Após cinco dias, quando as células atingirem a fase de diferenciação, adicione 1,5 mililitros de meio livre de soro contendo 2 nanomolares de BDNF e 1% de antibiótico-antimicótico no topo da construção. Adicione meio suplementado com vitamina C fresco na parte inferior da construção. Cultive as células por mais dois dias antes do processamento para análise posterior.