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Coloque uma lâmina de vidro com uma amostra de tecido fixa em um tampão de recuperação de antígeno e aqueça-a.
A temperatura elevada e o pH alcalino do tampão quebram as ligações cruzadas de proteínas induzidas pela fixação, expondo os epítopos do antígeno.
Resfrie a lâmina para evitar danos aos tecidos induzidos pelo calor e, em seguida, enxágue para remover o excesso de tamponamento.
Aplique uma barreira hidrofóbica e coloque a lâmina em uma câmara de umidade.
Adicione um tampão de bloqueio de permeabilização. O detergente do tampão permeia as membranas celulares e as proteínas de bloqueio mascaram locais de ligação não específicos para reduzir a coloração de fundo.
Remova o excesso de tampão, adicione um coquetel de anticorpos conjugados com metal e incube para permitir a ligação do anticorpo a antígenos específicos.
Lave a lâmina, removendo os anticorpos não ligados.
Adicione uma coloração nuclear conjugada com metal que entra nas células e se liga ao DNA.
Enxágue o excesso de manchas e seque a lâmina.
Usando um scanner óptico, obtenha imagens de alta resolução das características estruturais do tecido, o que ajuda na interpretação dos dados da análise de citometria de massa da amostra corada.
Comece com uma seção de tecido pré-tratado de cinco micrômetros montada sobre uma lâmina compatível com imunocoloração. Coloque os slides em uma mala direta de slides.
Para recuperação de epítopos induzida por calor ou HIER, adicione tampão HIER no envelope deslizante até que o tecido esteja completamente imerso. Coloque a mala direta deslizante em uma câmara de descamuflagem e inicie o programa de aquecimento.
Após o término do programa, coloque a mala direta deslizante em uma bandeja cheia de água fria e deixe esfriar. Enxágue as lâminas com água destilada várias vezes, aumentando gradualmente o volume.
Remova os slides da mala direta do slide e limpe o excesso de buffer. Para evitar a perda de tampão de bloqueio e anticorpos, circunde o tecido usando uma caneta de barreira hidrofóbica.
Incube as lâminas em uma câmara de umidade personalizada por uma hora. Para bloqueio não específico, adicione tampão de bloqueio às lâminas na câmara de umidade. Após o período de incubação, remova o excesso de tampão de bloqueio e deixe o tampão restante secar ao ar em temperatura ambiente.
Adicione cuidadosamente a solução de anticorpos sobre o tecido e incube durante a noite em uma câmara de umidade a quatro graus Celsius.
Após a incubação, lave a lâmina com PBS contendo Triton por 5 minutos. Por fim, enxágue a lâmina duas vezes com PBS por 5 minutos cada. Agora, trate o tecido com o corante intercalador e incube-o na câmara de umidade em temperatura ambiente por trinta minutos.
Após a incubação, lave a lâmina com água de HPLC por cinco minutos e seque-a em um dessecador por trinta minutos.
Quando a lâmina estiver seca, digitalize usando um scanner de documentos de mesa com uma resolução não inferior a 1200 pontos por polegada.