Gravações de Patch-Clamp do Dendrito de um Neurônio Dopaminérgico em uma Fatia de Cérebro

Comece com uma configuração de eletrofisiologia com uma fatia de cérebro imobilizada submersa em um líquido cefalorraquidiano artificial ou aCSF contendo diferentes íons.

A configuração inclui uma pipeta de remendo preenchida com uma solução rica em potássio conectada a um eletrodo de gravação e um amplificador.

Aplique pressão de ar positiva na pipeta para evitar seu entupimento. Em seguida, posicione-o perto de um dendrito, a extensão receptora de sinal de um neurônio dopaminérgico.

A ondulação da membrana resultante confirma a proximidade com o dendrito.

Libere a pressão positiva para criar sucção, formando uma vedação firme entre a pipeta e a membrana dendrítica.

Registre o movimento inicial do íon como uma corrente de ação na tensão da linha de base.

Fluxo de aCSF com bloqueadores dos canais de sódio e cálcio para bloquear os respectivos canais, impedindo o movimento de íons através deles.

Aplique uma tensão negativa para abrir um canal catiônico dependente de tensão.

Este canal permite que os íons de potássio entrem no neurônio, aumentando a corrente de ação e sugerindo estimulação do dendrito em um neurônio dopaminérgico.

Neste procedimento, transfira uma fatia de cérebro para a câmara de gravação. Fixe a fatia na parte inferior da câmara de gravação com um anel de platina e certifique-se de que a fatia seja de boa qualidade com uma superfície lisa e uniforme. Em seguida, selecione um neurônio com um dendrito que se estende por uma longa distância no mesmo plano e certifique-se de que o dendrito de interesse possa ser seguido até um soma bem definido. Em seguida, encha a pipeta de remendo com solução de eletrodo.

Para remendar o dendrito no modo ligado à célula, identifique e concentre-se em uma parte do dendrito. Aplique pressão positiva na pipeta e abaixe-a usando o micromanipulador. Em seguida, posicione a pipeta perto da membrana e ajuste a pressão para criar uma pequena covinha. Em seguida, libere a pressão na ponta da pipeta e remende o dendrito enquanto controla a resistência da pipeta. Tente obter uma resistência de vedação maior que 1 giga ohm, na melhor das hipóteses entre 3 e 10 giga ohms para gravações conectadas a células.

Depois, retraia a pipeta para longe da membrana em alguns micrômetros para evitar a deformação do dendrito. As correntes de ação vistas aqui representam os potenciais de ação espontânea dos neurônios nigrais. Para suprimir as correntes de ação, aplique bloqueadores dos canais de cálcio e sódio na ACSF. Em seguida, aplique um passo de tensão de menos 90 milivolts a partir de um potencial de retenção de 0 milivolts para evocar a corrente catiônica ativada por hiperpolarização.