JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:45 min • July 8th, 2025
Pegue uma fatia do tronco cerebral de camundongo contendo o núcleo vestibular medial, ou MVN.
Prenda a fatia em uma câmara de registro cheia de líquido cefalorraquidiano artificial para manter a viabilidade neuronal.
Visualize a fatia sob um microscópio para localizar neurônios MVN.
Aplique pressão positiva para avançar uma micropipeta preenchida com uma solução que imita o ambiente intracelular através do tecido.
À medida que a pipeta entra em contato com um neurônio, a membrana neuronal diminui.
Aplique pressão negativa para aspirar uma pequena porção da membrana, criando uma vedação hermética.
Em seguida, aplique pulsos de pressão negativa para romper a membrana, criando uma conexão contínua entre o neurônio e a pipeta.
Aplique amplitudes de ruído aleatórias ao neurônio e identifique uma amplitude subliminar além da qual o ruído induz o disparo neuronal.
Finalmente, aplique uma gama de estímulos elétricos ao neurônio combinados com a amplitude do ruído aleatório subliminar.
Meça o ganho neuronal - a capacidade do neurônio de modular sua resposta de disparo aos estímulos na presença de ruído.
Para eletrofisiologia de patch clamp de células inteiras, primeiro, puxe micropipetas com uma resistência final que varia de 3 a 5 megaohms quando preenchidas com uma solução interna à base de potássio e coloque no banho. Para obter gravações de patch clamp de células inteiras de neurônios individuais no MVN, transfira uma única fatia de tecido da câmara de incubação para a câmara de gravação de uma configuração eletrofisiológica padrão e use um fio de náilon em um peso em forma de U para prender a fatia.
Perfundir continuamente a câmara de registro com aCSF carbogenado a 25 graus Celsius a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto e encher uma micropipeta com solução interna. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva usando uma pipeta para empurrar os detritos para longe da ponta da pipeta. Usando uma objetiva de menor potência, localize o MVN antes de mudar para uma alta potência para localizar neurônios individuais dentro do MVN.
Antes de romper o tecido com a pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva para empurrar os detritos para longe da ponta da pipeta e use o micromanipulador para mover a pipeta em direção ao neurônio selecionado. Uma pequena covinha deve se formar na membrana neuronal. Libere a pressão positiva e aplique uma pequena quantidade de pressão negativa.
Uma vez que uma vedação de um gigaohm tenha sido alcançada, aplique uma pressão negativa suave, curta e aguda ao porta-pipeta através da porta de sucção para romper a membrana e criar uma configuração de célula inteira. Em seguida, obtenha registros de pinça de corrente de célula inteira de acordo com os protocolos padrão.
Para aplicar ruído estocástico e sinusoidal a neurônios individuais do núcleo vestibular medial, defina a faixa de amplitudes de 3 a 24 picoamperes para determinar o limiar neuronal e a taxa de disparo e agrupe as intensidades de estímulo mais baixas e mais altas para determinar o limiar sensorial.
Em seguida, calcule a taxa média de disparo durante o período de 10 segundos durante o qual a etapa de corrente despolarizante será injetada para cada nível de corrente individual. Use os valores médios de taxa de disparo para gerar uma taxa de disparo em relação ao gráfico atual. Em seguida, realize uma análise de regressão linear para determinar o gradiente da linha de melhor ajuste para determinar o ganho neuronal.