Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:57 min. • July 8th, 2025
Pegue as células ganglionares da retina do peixe-zebra cultivadas em lamínulas revestidas.
Essas células expressam um biossensor geneticamente codificado que produz a proteína fluorescente verde sensível à redox roGFP2 fundida a uma enzima sensível ao peróxido de hidrogênio, Orp1.
Transfira a lamínula com meio para uma câmara de imagem de células vivas e coloque a câmara em um microscópio invertido.
Substitua a mídia por mídia sem soro para reduzir a fluorescência de fundo.
Devido aos baixos níveis de peróxido de hidrogênio, o roGFP2 permanece em sua conformação reduzida.
Excite o biossensor sequencialmente nos comprimentos de onda de 405 e 480 nm.
O roGFP2 reduzido exibe um pico de excitação a 480 nm.
Mude para uma mídia contendo peróxido de hidrogênio.
O peróxido de hidrogênio entra nas células e reage com Orp1, oxidando roGFP2.
Excite o biossensor novamente.
O roGFP2 oxidado exibe um aumento de fluorescência em 405 nm e uma diminuição em 480 nm.
Calcule a razão de intensidade de fluorescência.
Um aumento na proporção indica aumento dos níveis de peróxido de hidrogênio celular.
No dia da imagem, verifique as células ao microscópio para validar o crescimento dos axônios RGC. Para
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