JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:57 min • July 8th, 2025
Pegue as células ganglionares da retina do peixe-zebra cultivadas em lamínulas revestidas.
Essas células expressam um biossensor geneticamente codificado que produz a proteína fluorescente verde sensível à redox roGFP2 fundida a uma enzima sensível ao peróxido de hidrogênio, Orp1.
Transfira a lamínula com meio para uma câmara de imagem de células vivas e coloque a câmara em um microscópio invertido.
Substitua a mídia por mídia sem soro para reduzir a fluorescência de fundo.
Devido aos baixos níveis de peróxido de hidrogênio, o roGFP2 permanece em sua conformação reduzida.
Excite o biossensor sequencialmente nos comprimentos de onda de 405 e 480 nm.
O roGFP2 reduzido exibe um pico de excitação a 480 nm.
Mude para uma mídia contendo peróxido de hidrogênio.
O peróxido de hidrogênio entra nas células e reage com Orp1, oxidando roGFP2.
Excite o biossensor novamente.
O roGFP2 oxidado exibe um aumento de fluorescência em 405 nm e uma diminuição em 480 nm.
Calcule a razão de intensidade de fluorescência.
Um aumento na proporção indica aumento dos níveis de peróxido de hidrogênio celular.
No dia da imagem, verifique as células ao microscópio para validar o crescimento dos axônios RGC. Para imagens de células vivas, transfira as lamínulas da placa de cultura para uma câmara de imagem de células vivas. Use um microscópio invertido equipado com uma objetiva DIC, filtro vermelho passa-longo OG590 e uma câmera EM-CCD.
Antes de fazer a imagem, substitua o meio ZFCM+ por ZFCM-. Depois de posicionar as células com a objetiva de 10x, adquira imagens com ampliação de 60x usando uma objetiva de imersão em óleo. Use uma ampliação adicional de 1,5x.
Primeiro, adquira imagens DIC e, em seguida, crie imagens roGFP2-Orp1 usando um conjunto de filtros apropriado. Depois de tirar o primeiro conjunto de imagens, troque a mídia por mídia contendo diferentes soluções de tratamento. O meio deve ser trocado a cada 30 minutos de imagem para evitar alterações de pH e osmolaridade.