Estabelecendo uma configuração de célula inteira para imagens de cálcio de dois fótons de fatias cerebrais
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:44 min • July 8th, 2025
Pegue uma pipeta de estimulação contendo fluoróforos vermelhos insensíveis ao cálcio no líquido cefalorraquidiano artificial, ou ACSF.
Posicione a pipeta perto do neurônio alvo em uma fatia do hipocampo.
Coloque uma pipeta de adesivo com um eletrodo de registro banhado em um eletrólito contendo fluoróforos vermelhos insensíveis ao cálcio e indicadores de cálcio verde perto do alvo.
Aplique pressão positiva constante para perturbar brevemente a superfície do tecido, indicando proximidade com o alvo.
À medida que a covinha se forma na membrana neuronal, libere a pressão para formar uma vedação.
Aplique pressão negativa para apertar a vedação.
Estabilize o potencial da membrana em uma tensão negativa constante.
Continue com pressão negativa para romper a membrana, permitindo que os eletrólitos contendo fluoróforo se espalhem dentro do neurônio.
Visualize a fluorescência vermelha da coluna dendrítica alvo e alinhe a pipeta de estimulação perto dela.
Aplique pulsos elétricos para abrir os canais de cálcio.
Use microscopia de dois fótons para visualizar mudanças transitórias nos níveis de cálcio, conforme indicado pela fluorescência verde.
Nesta etapa, transfira uma fatia do hipocampo para um banho sob a objetiva de um microscópio de dois fótons de varredura a laser. Perfundir continuamente o banho com ACSF oxigenado normal. Em seguida, use a Microscopia de Contraste de Interferência Diferencial Infravermelha para localizar uma célula de interesse usando seu tamanho, forma e posição.
Depois disso, encha uma pipeta estimulante com uma solução normal ACSF contendo o fluoróforo vermelho. Abaixe-o em cima da fatia para que a ponta fique na mesma região da célula de interesse. Em seguida, encha a pipeta de remendo com solução de remendo e conecte-a ao estágio principal. Coloque-o sobre a fatia de forma que sua ponta fique diretamente acima da célula de interesse.
Em seguida, encaixe uma seringa na torneira de três vias e conecte-a à pipeta de adesivo através de um tubo de plástico. Injete pressão positiva constante na pipeta de remendo e mantenha a torneira na posição fechada. Abaixe a pipeta de adesivo até que esteja bem em cima da célula alvo. Ao entrar em contato com a membrana celular, remova a pressão girando a torneira para a posição aberta.
Em seguida, aplique uma leve pressão negativa na pipeta de remendo usando uma seringa vazia encaixada na torneira até que a resistência da pipeta atinja 1 giga ohm. Na janela de teste de membrana do software de aquisição de dados, clamp a célula em 60 milivolts negativos. Continue aplicando pressão negativa até que a resistência da pipeta caia e toda a configuração da célula seja alcançada.
Para registrar transientes de cálcio dendrítico induzidos por estimulação elétrica, localize um dendrito de interesse usando o sinal fluorescente vermelho. Coloque a pipeta estimulante na superfície da fatia acima do dendrito de interesse. Abaixe lentamente a pipeta de estimulação de 10 a 15 micrômetros do dendrito, minimizando o movimento para evitar perturbar a configuração de toda a célula.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para visualizar transientes de cálcio em neurônios do hipocampo utilizando microscopia de dois fótons. A técnica envolve o uso de pipetas de estimulação e de grampo para manipular e registrar atividade de neurônios-alvo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- O sinalização de cálcio é crucial para a função neuronal.
- A microscopia de dois fótons permite a obtenção de imagens com alta resolução de neurônios vivos.
- Compreender a dinâmica do cálcio pode fornecer insights sobre o comportamento neuronal.
- As técnicas de patch-clamp são essenciais para estudar as propriedades celulares.
Objetivo do Estudo
- Visualizar transientes de cálcio em espinhos dendríticos de neurônios do hipocampo.
- Demonstrar o uso de técnicas combinadas de eletrofisiologia e imageamento.
- Aprimorar o entendimento da atividade sináptica e da sinalização neuronal.
Métodos Utilizados
- Preparação de fatias hipocampais para experimentação.
- Uso de pipetas de estimulação e de patch para manipulação direcionada.
- Aplicação de microscopia de dois fótons para imagem dos níveis de cálcio.
- Registro de atividade elétrica e transientes de cálcio em neurônios.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de transientes de cálcio em resposta à estimulação elétrica.
- Demonstração da eficácia das técnicas combinadas.
- Identificação de espinhos dendríticos específicos envolvidos na atividade sináptica.
- Compreensão da dinâmica da sinalização de cálcio em neurônios.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica do cálcio neuronal.
- A combinação de eletrofisiologia com imagem melhora nossa compreensão da função neuronal.
- Essa abordagem pode ser aplicada a diversos estudos em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O registro por microeletrodo de placa inteira combinado à imagem de cálcio com microscopia de dois fótons permite a investigação precisa da dinâmica de cálcio neuronal em fatias cerebrais, apoiando a redução de riscos mecanicistas na descoberta precoce de fármacos para o SNC. Essa abordagem fornece dados quantitativos e de alta resolução sobre a função sináptica e sinalização, contribuindo para a validação de alvos e análise de vias. Sua integração aos fluxos de trabalho de descoberta aumenta a confiança preditiva dos portfólios neurofarmacológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a medição direta de transientes de cálcio neuronal para a validação funcional de alvos.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao esclarecer as vias de sinalização sináptica.
- Fornece dados quantitativos para orientar decisões de avançar/não avançar em portfólios de alvos do SNC.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Estabelece sistemas validados de fatias cerebrais para triagem de compostos posteriores.
- Fornece leituras quantitativas reprodutíveis de sinalização de cálcio para padronização de ensaios.
- Facilita a avaliação confiável de moléculas candidatas que afetam a excitabilidade neuronal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a atividade neuronal in vitro com biomarcadores sinápticos relevantes para a doença.
- Apóia a continuidade do descobrimento mecanicista até a validação pré-clínica em modelos do SNC.
- Permite o avanço ajustado ao risco de compostos neuroativos com base em resultados funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método situa-se na interseção entre descoberta inicial e pesquisa pré-clínica, conectando estudos mecanicistas e validação translacional no desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central.
- Biologia da Descoberta: Fornece evidência direta para o teste de hipóteses sobre mecanismos de sinalização neuronal.
- Triagem: Oferece saídas quantitativas e reprodutíveis de imagem de cálcio para prontidão do ensaio.
- Análises: Permite comparação estatística de respostas sinápticas sob diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a padrões de atividade neuronal relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Atua como uma plataforma reutilizável para investigações diversas de alvos e vias do SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Padroniza e amplia ensaios neuronais de alta resolução para uso entre diferentes projetos.
- Valor Estratégico: Melhora o triagem de portfólios e a alocação de capital ao fornecer dados funcionais robustos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos neurofarmacológicos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em eletrofisiologia e técnicas avançadas de imagem.
- Requer acesso a microscopia de dois fótons e instrumentação de patch-clamp.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para reprodutibilidade.
- Pode exigir adaptação para diferentes subtipos neuronais ou regiões cerebrais.
- Depende da qualidade do tecido e do desempenho do fluoróforo para resultados ótimos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1
Vídeos relacionados
0 Visualizações
A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Última atualização: 29 agosto 2026