Registros eletrofisiológicos para avaliação de regenerações neuronais em fatias de medula espinhal co-cultivadas

Pegue uma matriz de múltiplos eletrodos revestida de polímero ou MEA, com fatias de medula espinhal embrionária co-cultivadas posicionadas em duas zonas separadas, permitindo a gravação simultânea de ambas as fatias.

A fatia mostra conexões neurais regeneradas na área previamente lesionada.

Coloque o MEA em uma câmara de registro contendo uma solução extracelular rica em íons e nutrientes para manter a sobrevivência neuronal.

Permitir que o sistema se estabilize, facilitando a adaptação e comunicação dos neurônios.

Os neurônios se comunicam por meio de sinais elétricos chamados potenciais de ação, que são registrados pelos eletrodos próximos no MEA.

Sinais individuais de cada eletrodo são combinados, produzindo um sinal elétrico de cada fatia.

Substitua regularmente a solução extracelular para manter a estabilidade dos neurônios.

Adicione uma solução extracelular com inibidores que bloqueiam os receptores de neurotransmissores inibitórios nas membranas neuronais, mantendo os neurônios ativos por mais tempo.

Compare a atividade elétrica de ambas as fatias. Um sinal elétrico sincronizado entre as duas fatias confirma as conexões sinápticas e a regeneração neural bem-sucedida.

Coloque uma placa de Petri com uma matriz de microeletrodos revestida dentro sob um estereomicroscópio. Coloque a matriz em foco e centralize uma gota de seis microlitros de plasma de galinha na matriz de eletrodos. Usando uma pequena espátula, deslize cuidadosamente duas seções da medula espinhal com seus lados ventrais voltados um para o outro na gotícula de plasma.

Em seguida, adicione oito microlitros de trombina ao redor da gota de plasma de frango. Em seguida, use a ponta da pipeta para misturar e espalhar cuidadosamente a mistura de plasma de frango e trombina. Pouco antes de a mistura de plasma e trombina de frango ficar muito fibrosa e começar a coagular, aspire o excesso de líquido. Em seguida, tampe a placa de Petri e coloque-a em uma câmara umidificada.

Coloque a câmara dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius por cerca de uma hora. Após a incubação, adicione cuidadosamente 10 microlitros de meio nutriente à amostra. Tampe a placa de Petri e coloque-a de volta na incubadora por mais 45 minutos. Em seguida, coloque cada um dos conjuntos de cultura de matriz de vários eletrodos em um tubo de rolo e adicione três mililitros de meio nutriente. Feche bem a tampa e coloque o tubo do rolo no tambor do rolo. Gire o tambor a 1 a 2 RPM na incubadora a 37 graus Celsius.

Usando uma pinça com ponta de borracha estéril, remova os conjuntos de cultura de matriz de múltiplos eletrodos do tubo do rolo e coloque-os em uma placa de Petri sob um estereomicroscópio. Colocar o tecido em foco e verificar se as duas fatias estão fundidas. Em seguida, segure o conjunto com firmeza e coloque uma lâmina de bisturi na ranhura da matriz de multieletrodos perto das fatias de tecido. Segure o bisturi na horizontal e, em seguida, levante o cabo do bisturi, mas deixe a lâmina do bisturi ficar na ranhura da matriz de forma que a lâmina role da base às pontas, cortando o tecido, cobrindo a ranhura.

Corte quaisquer conexões de tecido residual com uma ponta de agulha de calibre 25, se necessário. Trabalhe apenas na área dentro da ranhura e não toque nas bordas sensíveis. Coloque os conjuntos de culturas de matriz de vários eletrodos de volta no tubo do rolo e adicione três mililitros de meio nutriente fresco às culturas. Em seguida, coloque o tubo do rolo de volta no tambor do rolo na incubadora a 37 graus Celsius.

Monte um conjunto de cultura de matriz de vários eletrodos em uma câmara de gravação e aplique cerca de 500 microlitros de solução extracelular na matriz. Em seguida, monte o conjunto no microscópio. Aguarde 10 minutos para que o sistema se estabilize e, em seguida, registre a atividade espontânea básica de cada um dos eletrodos de detecção de atividade por 10 minutos. Repita as gravações um total de duas vezes.

Para garantir condições extracelulares estáveis, troque a solução extracelular após cada sessão de gravação. Se desejar, desinibir a rede aplicando solução extracelular contendo um micromolar de estricnina e 10 micromolar de gabazina e aguarde pelo menos dois minutos antes de registrar a atividade elétrica.