Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:10 min. • July 8th, 2025
Comece com uma câmara de registro de comportamento contendo uma larva de peixe-zebra transgênica anestesiada imobilizada em uma agarose de baixo ponto de fusão.
A região do pretectum do mesencéfalo da larva e o lobo inferior do hipotálamo contêm neurônios modificados que expressam indicadores fluorescentes de cálcio.
Remova a agarose ao redor da cabeça da larva e lave com água para remover qualquer agarose residual.
Coloque um paramécio como presa perto da larva.
Transfira a câmara de registro para um microscópio de fluorescência.
À medida que a presa nada, o olho da larva a detecta e envia um sinal para as regiões do pré-teto e do hipotálamo envolvidas na detecção da presa.
Isso abre canais de cálcio nesses neurônios, permitindo que os íons de cálcio entrem e se liguem aos indicadores de cálcio, levando à emissão de fluorescência.
Registre a imagem de lapso de tempo para detectar a intensidade de fluorescência dos neurônios ao longo do caminho de natação da presa e gere um mapa de cores.
Neste mapa, as pontas das setas representam as trajetórias das presas: as setas pretas não mostram excitação neuronal, enquanto as setas coloridas indicam aumento da excitação neuronal desencadeada pelo movimento da presa.
Depois de cultivar paramécia e anestesiar uma larva de peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, coloque a larva em agarose de baixo ponto de fusão a 2% e remova imediatamente qualquer excesso de agarose para que a superfície da agarose pareça ligeiramente convexa. Usando uma agulha de dissecação, oriente rapidamente a larva na posição vertical.
Em seguida, usando uma faca cirúrgica, faça alguns pequenos cortes na agarose para remover a agarose ao redor da cabeça do peixe-zebra, o que abre espaço para o paramécio nadar. Remova cuidadosamente a agarose residual despejando suavemente a água do sistema na câmara. Em seguida, coloque um paramécio na câmara de gravação para servir como estímulo visual.
Em seguida, coloque a câmara de gravação sob um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera CMOS científica e selecione uma lente objetiva de 2,5x. Inicie o aplicativo de aquisição de imagem para a câmera equipada. Clique em Painel de Sequência e selecione Registro de Disco Rígido no painel. Na seção Configurações de varredura, defina a contagem de quadros como 900 ou qualquer outro número total de quadros desejado.
No painel Capturar, defina o Tempo de Exposição em 30 milissegundos e o Compartimentalização como 2 por 2. Clique em Ao vivo no painel de captura para localizar a larva no modo de exibição e foco da câmera e, em seguida, clique em Parar ao vivo e clique no botão Iniciar. Salve o filme no formato .cxd e analise os dados de acordo com o protocolo de texto.