Medição dos níveis de glutamato cerebral sob anestesia em leitões neonatais usando um arranjo de microeletrodos

Prenda um leitão neonatal anestesiado a uma estrutura estereotáxica.

Faça uma incisão na linha média para revelar o crânio.

Remova uma parte do crânio e, em seguida, remova a dura-máter para acessar o cérebro.

Fixe uma matriz de microeletrodos, ou MEA, ao quadro estereotáxico.

O MEA consiste em uma haste rígida e locais de registro, incluindo locais sensíveis ao glutamato revestidos com glutamato oxidase e locais sentinela revestidos com uma matriz proteica inativa.

Posicione o MEA verticalmente sobre o local da cirurgia e coloque um eletrodo de pseudo-referência sob o couro cabeludo para uma referência de tensão de linha de base estável.

Insira o MEA na região do cérebro de interesse e inicie a medição.

A glutamato oxidase nos locais de registro converte o glutamato cerebral extracelular em peróxido de hidrogênio, que sofre oxidação eletroquímica na superfície do eletrodo, gerando corrente.

Os locais sentinela medem o ruído de fundo.

Normalize os sinais do local sensível ao glutamato para os sinais do local sentinela para medir os níveis cerebrais de glutamato sob anestesia.

Para começar, crie uma incisão na linha média de 4 a 6 centímetros ao longo do crânio com cuidado para evitar marcar o crânio com o bisturi. Uma vez feita a incisão, use retração suave e dissecção romba para elevar o couro cabeludo do crânio.

Em seguida, esfregue suavemente o crânio com uma gaze para remover qualquer tecido conjuntivo e expor as linhas de sutura. Em seguida, determine o local pretendido para a craniotomia. Se a área de interesse permanecer obscurecida, reflita ainda mais o couro cabeludo.

Agora, use uma broca cirúrgica para criar uma janela de craniotomia com cerca de 0,25 centímetros quadrados sobreposta à estrutura de interesse. Tenha cuidado para não ferir a dura-máter ou o cérebro subjacente. Conforme necessário, use ferramentas cirúrgicas finas para extirpar a dura-máter que cobre o tecido cerebral. Tenha extremo cuidado para evitar danos ao cérebro.

Este experimento utiliza uma matriz de microeletrodos baseada em enzima descrita anteriormente, pré-revestida com glutamato oxidase e galvanizada com MPD. As matrizes de microeletrodos têm uma haste rígida de 40 milímetros personalizada para uso com leitões. Prenda o braço de metal ao micromanipulador e, em seguida, posicione o conjunto de microeletrodos o mais verticalmente possível sobre o bregma.

Em seguida, abaixe cuidadosamente a matriz o mais baixo possível sem tocar na superfície do crânio, observando as coordenadas de bregma. Agora, use um atlas do cérebro de leitão para determinar as coordenadas estereotáxicas exatas da estrutura de interesse. Em seguida, reposicione o microeletrodo de acordo.

Em seguida, coloque o eletrodo de pseudo-referência sob o couro cabeludo, garantindo o contato com o animal. Agora, abaixe lentamente a matriz de microeletrodos no cérebro até quase a profundidade apropriada. Para os 2 milímetros finais de curso, use um microdrive hidráulico para abaixar suavemente a matriz na estrutura de interesse com o mínimo de trauma tecidual.

Depois que o feixe de microeletrodos estiver posicionado, aguarde 30 minutos para permitir que os eletrodos atinjam a linha de base. Em seguida, faça medições por cerca de três horas. Se o leitão sobreviver ao experimento, feche a incisão após a coleta de dados.