Induzindo Varicosidades Axonais com um Estímulo Micromecânico nos Neurônios

Comece prendendo uma micropipeta com tubo conectado a um micromanipulador.

Conecte a outra extremidade do tubo a uma seringa cheia de tampão de sal por meio de um conector com uma válvula giratória.

Coloque a seringa a uma altura que forneça pressão suficiente para induzir varicosidades nos axônios.

As varicosidades axonais são inchaços semelhantes a contas que ocorrem ao longo do comprimento de um axônio.

Posicione a micropipeta no ângulo desejado em relação à placa de cultura.

Use luz fluorescente do microscópio para alinhar a ponta da micropipeta e abaixe-a perto da superfície da placa de cultura de células contendo tampão de sal.

Agora, ligue a luz transmitida e desligue o filtro fluorescente.

Coloque uma lamínula com neurônios no prato.

Primeiro, concentre-se na micropipeta e ajuste sua posição.

Em seguida, concentre-se na região que contém os neurônios-alvo.

Abra a válvula para aplicar pressão de fluido. Esse estímulo micromecânico induz varicosidades nesses neurônios.

Neste procedimento, insira a pipeta na tampa rosqueada do micromanipulador para mantê-la no lugar. Incline a pipeta em um ângulo de 45 graus com a superfície da placa de cultura de células. Ligue o filtro de fluorescência. Abra a abertura e certifique-se de que um ponto fluorescente possa ser visto passando pela objetiva.

Usando o micromanipulador, mova a pipeta para uma posição que alinhe a ponta com o ponto fluorescente e abaixe a pipeta para uma posição logo acima da altura da placa de cultura de células. Quando estiver na posição, ligue a luz transmitida e desligue a fluorescência. Usando uma pinça, transfira uma lamínula com as células voltadas para a pipeta da placa de cultura de células para a placa de cultura de células contendo 2 mililitros de tampão de Hank à temperatura ambiente.

Usando o botão de foco fino e a objetiva de 20 vezes, concentre-se em um plano cerca de quatro voltas completas acima das células. Em seguida, use o micromanipulador para posicionar a ponta da pipeta de forma que fique focada e no lado central esquerdo do plano, conforme visto através das oculares. Quando a pipeta estiver posicionada, focalize o microscópio em um plano que contenha a região de interesse.

Na imagem de 7DIV, os neurônios do hipocampo de camundongos transfectados por GFP mostraram um axônio pré e pós-insopro.