Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 5:10 min. • July 8th, 2025
Coloque embriões de peixe-zebra geneticamente modificados sob um estereomicroscópio e observe o enrolamento espontâneo da cauda desencadeado pelos neurônios motores da medula espinhal.
As propriedades intrínsecas desses neurônios causam o influxo de íons através dos canais de sódio, levando à despolarização espontânea da membrana e à geração de potenciais de ação que se propagam para os músculos, desencadeando o enrolamento da cauda. Meça a frequência de enrolamento.
Transfira alguns embriões para um bloqueador dos canais de sódio para inibir o influxo de sódio e avaliar a frequência de enrolamento reduzida.
Monte embriões não tratados em agarose derretida; deixe a agarose solidificar para restringir o movimento e observe sob um microscópio de fluorescência.
Os neurônios motores expressam um biossensor com um domínio de detecção de voltagem ligado à membrana, ou VSD, fundido a fluoróforos doadores e aceptores.
A despolarização altera a conformação do VSD, aproximando os fluoróforos.
Após a excitação, o doador transfere energia para o receptor, causando emissão de fluorescência do aceitador.
Adicione o bloqueador para inibir a despolarização, o que reduz a emissão do aceptor, confirmando a inibição mediada por bloqueador da despolarização espontânea nos neurônios.
Para análise espontânea de enrolamento da cauda, transfira os embriões para uma placa de Petri redonda de 90 milímetros cheia de água de peixe contendo 0,2% de DMSO e descorione-os manualmente usando duas pinças de joalheiro com pontas afiadas ou agulhas. Depois, incube os embriões por 5 minutos a 28 graus Celsius. Usando uma câmera digital montada em um estereomicroscópio, detecte o enrolamento da cauda à temperatura ambiente durante uma gravação de vídeo de um minuto.
Em seguida, adquira a série temporal com uma resolução de tempo de 30 quadros por segundo. Em seguida, calcule a frequência de enrolamento espontâneo da cauda contando o número de curvas por unidade de tempo. Para avaliar o efeito da droga riluzol, transfira os embriões para uma nova placa de Petri de 90 milímetros cheia de água de peixe contendo 5 micromolares de riluzol. Em seguida, incube os embriões por 5 minutos a 28 graus Celsius antes de gravar um vídeo de um minuto e realizar a análise comportamental.
Agora, monte os embriões de 20 a 24 hpf em agarose de baixo ponto de fusão a 1% em água de peixe dentro de uma placa de imagem com fundo de vidro de 35 milímetros a 37 graus Celsius. Oriente os embriões de lado e espere até que a agarose solidifique à temperatura ambiente.
Em seguida, transfira a placa de imagem para o estágio de um microscópio confocal. Identifique os neurônios motores que expressam o biossensor excitando o monomérico Umikinoko-Green com laser de argônio de 488 nanômetros. Em seguida, defina sua emissão entre 495 e 525 nanômetros e pressione Gravar.
Para uma medição de FRET, excite o mUKG, o doador do par FRET com um laser de 488 nanômetros. Simultaneamente, usando dois fotomultiplicadores, detecte a fluorescência emitida pelo doador e a fluorescência emitida pelo aceptor monomérico de Kusabira-Orange. No início do experimento, otimize o ganho e o deslocamento do fotomultiplicador 1, onde a fluorescência mUKG é registrada, e mantenha-os constantes durante toda a sessão.
Para definir o deslocamento, altere a cor da imagem para os valores de intensidade usando a tabela Q-lookup. Ao digitalizar com um laser desligado, use o controle deslizante de deslocamento para que os pixels de fundo tenham uma intensidade ligeiramente superior a zero. Usando a mesma tabela de pesquisa, ligue o laser. Durante a digitalização, use o controle deslizante de ganho para maximizar a relação sinal-ruído, tomando cuidado para evitar pixels saturados.
Na janela de aquisição de software, selecione o modo de aquisição xyt e um tamanho de campo de imagem de 512 por 64 pixels no menu suspenso. Em seguida, defina o registro das mudanças na voltagem do neurônio espinhal do embrião para adquirir um único plano xy a cada 30 milissegundos por um minuto. Avalie o efeito da administração de riluzol na despolarização da membrana no mesmo neurônio, adquira um novo conjunto de dados cinco minutos após a adição de água de peixe contendo 5 micromolares de riluzol.