JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 4:00 min • July 8th, 2025
Monte uma mosca Drosophila em um suporte com a cabeça exposta.
Crie uma abertura em um olho e remova a córnea para expor a retina.
Coloque o suporte na plataforma de gravação.
Insira um eletrodo de referência rombo contendo uma solução salina fisiológica na cápsula da cabeça.
Em seguida, insira um eletrodo de gravação afiado contendo uma solução intracelular que imita o ambiente através da abertura na retina.
Permita que o olho se adapte ao escuro.
Meça a resistência do eletrodo de gravação para garantir sua adequação para gravação.
Em seguida, elimine a diferença de tensão de linha de base entre os eletrodos de registro e referência.
Durante a adaptação ao escuro, canais iônicos específicos nas células fotorreceptoras da retina permanecem abertos, permitindo um influxo constante de íons positivos.
Estimule o olho com flashes de luz.
Em resposta, os canais iônicos se fecham, reduzindo o influxo de íons positivos e promovendo o efluxo.
Consequentemente, o potencial de membrana dos fotorreceptores torna-se mais negativo, medido pelo eletrodo de registro como uma queda na voltagem.
Ao operar o microeletrodo ampmais vivo, sempre seja aterrado tocando na superfície metálica da gaiola de Faraday ou mesa antivibração para evitar cargas estáticas. Prenda a mosca montada ao poste da plataforma de preparação da mosca.
Gire o porta-moscas de forma que o olho esquerdo da mosca fique diretamente voltado para o investigador. Em seguida, use um micromanipulador pequeno e grosso para inserir o eletrodo de referência rombo suavemente através dos ocelos da mosca na cápsula da cabeça. Certifique-se de que a mosca ainda pareça saudável e mova suas antenas. A preparação deve ser excelente para merecer registro.
Agora, dirija o microeletrodo de gravação afiado no olho esquerdo através da abertura revestida de gelatina. Ao entrar no tecido, a localização da ponta do eletrodo deve ser aparente por seu padrão de refletância. A ponta frágil do eletrodo deve ser guiada perfeitamente ou quebrará, o que é muito desafiador.
Dependendo do tipo de célula que está sendo registrada, a cabeça da mosca deve ser orientada de forma ligeiramente diferente. Com os eletrodos no lugar, ligue o microeletrodo amplificador. Em seguida, desligue a fonte de luz fria, desconecte-a da rede elétrica e conecte-a ao aterramento central para minimizar o ruído elétrico induzido pelo loop de aterramento.
Em seguida, ajuste as guias de luz gooseneck para que o sistema de braço cardan possa ser movido livremente ao redor da mosca. Em seguida, desligue as luzes da sala para colocar a preparação da mosca em relativa escuridão. Agora, meça a resistência do eletrodo de gravação no olho. Deve estar entre 100 e 250 megaohms.
Em seguida, ajuste o amplificador para pinça de corrente ou ponte e zere a tensão entre os eletrodos. Depois que a mosca tiver sido adaptada ao escuro por alguns minutos, coloque a ponta do eletrodo de gravação no olho em passos de 0.1 a 1 mícron usando um passo piezoelétrico ou usando uma rotação suave do botão de resolução fina.
A cada passo, estimule o olho com um flash de luz de 1 a 10 milissegundos. Cada flash de luz causará uma breve queda na tensão ou no ERG.