Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Comece com uma larva de peixe-zebra imobilizada e paralisada em uma câmara de registro preenchida com uma solução extracelular em uma configuração de eletrofisiologia.

Encha uma micropipeta aferente com a solução extracelular contendo íons que fornecem condutividade elétrica para registrar a atividade neuronal.

Monte-o em um micromanipulador contendo um eletrodo de gravação conectado a um amplificador para gravação de sinal.

Aplique pressão de ar positiva para evitar que a pipeta entupa.

Mova a ponta da pipeta ao longo do nervo da linha lateral e posicione-a adjacente ao gânglio aferente que contém um aglomerado de corpos celulares neuronais aferentes.

Os processos celulares desses neurônios estão conectados às células ciliadas localizadas ao longo da linha lateral, que detectam os movimentos da água.

Em seguida, aplique uma leve pressão negativa para formar uma vedação solta entre a micropipeta e o gânglio aferente.

Registre os sinais elétricos dos neurônios aferentes, que recebem a entrada sensorial das células ciliadas na larva imobilizada.

Imobilize as larvas de peixe-zebra e transfira-as para uma placa de Petri de 35 milímetros usando uma pipeta de transferência de ponta grande. Remova o máximo possível da solução circundante. Mergulhe as larvas em 10 microlitros de bungarotoxina alfa a 0,1% por aproximadamente cinco minutos. Lave a larva paralisada com solução extracelular por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta de transferência para mover a larva do banho de solução extracelular para o prato de gravação com fundo de silicone.

Sob um estereomicroscópio, posicione suavemente as larvas com pinças de ponta fina acima do centro do tapete de silicone, com o lado lateral para cima com as extremidades anterior e posterior do corpo da esquerda para a direita. Usando uma pinça de ponta fina, insira o pino gravado ortogonalmente ao silicone através da notocorda dorsal das larvas, diretamente dorsal ao ânus. Insira o segundo pino através da notocorda perto do final da cauda e insira o terceiro pino através da notocorda dorsal da bexiga de gás. Insira o quarto pino através da vesícula ótica enquanto fornece uma leve rotação à medida que o pino se insere no encapsulante.

À medida que uma ligeira rotação é aplicada, observe o tecido entre o cleitro e a vesícula ótica para revelar o aglomerado de somas aferentes. Coloque a lava fixada sob a objetiva de 10 vezes em um estágio fixo do microscópio DIC e oriente as fendas miosseptais dos blocos musculares paralelamente ao vetor do estágio da cabeça esquerda.

Coloque o fio terra na solução de banho e certifique-se de que ele esteja conectado ao cabeçote esquerdo stage. Encha o eletrodo de registro aferente com 30 microlitros de solução extracelular e insira-o no suporte de pipeta do estágio de cabeça direito. Em seguida, abaixe-o na solução do prato enquanto aplica pressão positiva produzida por um transdutor pneumático.

Localize o eletrodo e coloque a ponta do eletrodo sobre a amostra. Usando um micromanipulador, abaixe a ponta do eletrodo aferente até que ela esteja mantendo a posição acima do cleitrum Aumente a ampliação para 40 vezes a imersão e localize a interseção do nervo da linha lateral posterior e do cleitrum Traga a ponta do eletrodo sobre o gânglio aferente e abaixe a pipeta até que a ponta entre em contato com o epitélio. Suavemente, manobre o eletrodo para que toda a circunferência da ponta entre em contato com o gânglio aferente.