Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:10 min. • July 8th, 2025
Pegue uma fatia de cérebro de camundongo imobilizado corada com um corante sensível à voltagem ou VSD, moléculas fluorescentes que se integram à membrana neuronal e respondem às mudanças no potencial da membrana.
Coloque a fatia em uma câmara de gravação.
Instale o eletrodo de aterramento para uma referência de tensão de linha de base.
Em seguida, posicione os eletrodos de estimulação e gravação na fatia.
Aplique um pulso elétrico.
O pulso estimula os neurônios, desencadeando a abertura do canal de sódio dependente de voltagem e o influxo de íons de sódio, levando a uma mudança no potencial da membrana.
Isso induz um potencial de ação, medido pelo eletrodo de registro, e altera as propriedades fluorescentes do VSD.
Exponha a fatia do cérebro a um comprimento de onda específico para excitar o VSD e desencadear a emissão de fluorescência.
Após a estimulação, os canais de sódio se fecham enquanto os canais de potássio dependentes de voltagem se abrem, promovendo o efluxo de íons de potássio.
Isso altera o potencial da membrana novamente e, consequentemente, altera a fluorescência do VSD.
Registre a fluorescência em tempo real para representar visualmente a atividade neuronal.
Para iniciar este procedimento, ligue o amplificador, o computador e o sistema de câmera e abra o software. Despeje o aCSF em um tubo de 50 mililitros e borbulhe com carbogênio. Use uma bomba peristáltica para circular o aCSF e ajuste a taxa de fluxo para aproximadamente um mililitro por minuto.
Em seguida, ajuste a altura da pipeta de sucção para que o nível do líquido dentro da câmara do experimento seja sempre constante. Coloque o eletrodo de aterramento na câmara. Em seguida, encha o eletrodo de vidro com uma pequena quantidade de aCSF e coloque-o no porta-eletrodo. Fixe o suporte à haste do manipulador.
Usando um amplificador, certifique-se de que a resistência do eletrodo seja de aproximadamente 1 megaohm. Na sessão de gravação, transfira uma fatia da câmara úmida para uma câmara experimental. Pressione a borda do anel firmemente no O-ring de silicone. Tenha cuidado para não romper a membrana ou o fundo da câmara experimental.
Sob o microscópio, coloque a ponta do eletrodo estimulante e o eletrodo de registro de potencial de campo na fatia. Verifique a resposta evocada fornecendo um estímulo. Confirme se o campo de visão cobre o circuito neural correto no sistema de registro óptico.
Em seguida, ajuste a intensidade da luz de excitação para aproximadamente 70% a 80% da capacidade máxima da câmera. Usando a fonte de luz fluorescente, ajuste o foco com o sistema de aquisição. Em seguida, inicie a gravação e analise os dados em um software de aquisição de imagens após a aquisição.