Um estudo eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongo

Coloque uma fatia de cérebro de camundongo em uma câmara de gravação perfundida com uma solução de gravação oxigenada.

A fatia contém o núcleo geniculado lateral dorsal, ou dLGN, que é rico em neurônios de retransmissão. Esses neurônios formam sinapses retinogeniculadas com as projeções das células ganglionares da retina e sinapses corticogeniculadas com projeções neuronais do córtex visual.

Posicione uma pipeta estimulante no trato óptico para investigar sinapses retinogeniculadas ou no núcleo reticular tálamo para investigar sinapses corticogeniculadas.

Posicione uma pipeta de gravação perto da fatia. Usando um microscópio, localize um neurônio de retransmissão.

Aplique pressão positiva para evitar o entupimento da pipeta ao se aproximar do neurônio.

Mude para pressão negativa, formando um selo com a membrana celular, depois rompa-a para estabelecer continuidade com o citoplasma.

Usando a pipeta estimulante, forneça pulsos elétricos que induzem as projeções a liberar neurotransmissores excitatórios, que se ligam aos receptores sinápticos dos neurônios de retransmissão, desencadeando o fluxo de íons medido pela pipeta de registro.

Neste procedimento, puxe as pipetas de registro usando capilares de vidro borossilicato e um extrator de filamento. Em seguida, puxe as pipetas estimulantes usando o mesmo protocolo, mas quebre a ponta levemente após puxar para aumentar o diâmetro. Em seguida, encha as pipetas de registro com solução intracelular e biocitina e encha as pipetas estimulantes com solução de registro.

Em seguida, coloque as fatias na câmara de gravação e perfunda-as continuamente com solução de gravação oxigenada à temperatura ambiente. Visualize as fatias com um microscópio vertical equipado com microscopia de vídeo IR-DIC. Verifique todas as fatias e selecione aquelas que exibem tratos ópticos intactos. Coloque a pipeta estimulante na fatia antes de tapar a célula com a pipeta de gravação.

Para investigar as sinapses retinogeniculadas, coloque a pipeta estimulante diretamente no trato óptico, onde as fibras do axônio das células ganglionares da retina estão agrupadas. Para analisar as sinapses corticogeniculadas, coloque o eletrodo estimulante no núcleo reticular do tálamo, que é rostroventralmente adjacente ao núcleo geniculado dorsolateral. Assim que a pipeta de registro estiver imersa na solução de registro, aplique um passo de cinco milivolts para monitorar a resistência da pipeta.

Defina o potencial de retenção para zero milivolts e cancele o potencial de deslocamento para que a corrente de retenção seja zero picoampere. Aproxime-se da célula com uma pipeta de registro enquanto aplica pressão positiva. Quando a pipeta estiver em contato direto com a membrana celular, libere a pressão positiva e ajuste o potencial de retenção para menos 70 milivolts.

Em seguida, aplique uma leve pressão negativa para permitir que a membrana celular se prenda à pipeta de vidro de forma que se forme uma vedação de gigaohm. Compense a capacitância da pipeta e abra a célula aplicando pulsos de pressão negativa. Para investigar a função sináptica, aplique pulsos de corrente de 0,1 milissegundo através da pipeta de estimulação. Monitore a resistência em série continuamente aplicando um passo de cinco milivolts.

A resistência em série pode ser estimada dividindo cinco milivolts pela amplitude de pico da corrente evocada. Use apenas as células com resistência em série menor que 20 mega ohms para análise.