Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:05 min. • July 8th, 2025
Pegue uma fatia de cérebro de camundongo transfectado imobilizado em uma câmara de registro de eletrofisiologia perfundida com aCSF oxigenado.
Esta fatia contém terminais axônicos dos neurônios talâmicos que expressam canais iônicos sensíveis à luz fundidos a uma proteína fluorescente.
Visualize os axônios fluorescentes do neurônio talâmico e selecione um neurônio piramidal.
Avance uma pipeta de registro contendo um eletrodo em uma solução intracelular em direção ao neurônio selecionado com leve pressão positiva.
A pressão positiva cria uma covinha na membrana neuronal ao entrar em contato.
Libere a pressão para formar uma vedação de alta resistência.
Defina o potencial de membrana para um valor negativo constante.
Aplique um pulso de pressão negativa para romper a membrana, alcançando uma configuração de célula inteira.
Iluminar os terminais axônicos, ativando os canais sensíveis à luz e despolarizando as membranas neuronais, desencadeando potenciais de ação.
Neurotransmissores excitatórios são liberados, ligando-se a receptores no neurônio registrado, causando influxo de cátions.
Registre as correntes pós-sinápticas excitatórias resultantes, indicando uma conexão sináptica direta entre os neurônios.
Para realizar o registro do grampo de contato de células inteiras, transfira suavemente uma fatia de cérebro contendo o complexo hipocampal para a câmara de registro. Perfundir continuamente a câmara de gravação com 34 graus Celsius ACSF borbulhou com carbogênio a 2 a 3 mililitros por minuto. Examine brevemente a expressão de chronos GFP em terminais axônicos na região de interesse com iluminação LED azul com ampliação de 4x.
Mude para uma objetiva de imersão de 63x e ajuste o foco. Verifique se há axônios expressando Chronos GFP e escolha um neurônio piramidal para registro de patch. Em seguida, encha uma pipeta com solução interna à base de gluconato de potássio. Montagem Remende a célula na configuração de grampo de tensão.
Aproxime-se do neurônio identificado e pressione delicadamente a ponta da pipeta no soma. A pressão positiva deve produzir uma covinha na superfície da membrana. Em seguida, libere a pressão para criar uma vedação de giga ohm. Uma vez selado, defina a tensão de retenção para menos 65 milivolts.
Quebre a membrana com um pulso agudo de pressão negativa. Registre em corrente ou tensão as respostas pós-sinápticas da pinça à estimulação de campo inteiro de LED de 475 nanômetros de fibras aferentes expressando chronos. Estimule com trens de 10 estímulos de 2 milissegundos de duração a 20 hertz.