Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais

Comece perfundindo um líquido cefalorraquidiano artificial aerado ou aCSF sobre uma grade de malha em uma câmara de perfusão.

Transfira uma fatia de cérebro contendo neurônios que expressam proteínas fluorescentes e ancore-a com um dispositivo com fio de platina.

Gire a grade de malha para alinhamento.

Abaixe a sonda multicanal em direção à fatia.

Ajuste o cubo do filtro para visualização de proteínas fluorescentes.

Gire a fatia para alinhar a sonda.

Ajuste a altura da sonda abaixo da superfície do tecido.

Agora, perfunda o aCSF e concentre-se nos neurônios marcados com fluorescência.

Usando uma objetiva de alta potência, concentre-se no tecido e ajuste a luz de excitação.

Use um filtro de luz apropriado para observar a fluorescência nos neurônios.

Ajuste a lente objetiva para criar espaço para a pipeta de remendo e aplique pressão positiva.

Em seguida, posicione a pipeta perto do neurônio para formar uma covinha de membrana.

Finalmente, aplique sucção fraca para criar uma vedação de membrana, seguida de sucção forte para quebrar a membrana e obter registros elétricos do neurônio alvo.

Para colocar a sonda multicanal na lâmina de tecido cerebral ex vivo, perfunda ACSF experimental borbulhado de três a seis mililitros por minuto e transfira a fatia do cérebro contendo a área de interesse para a grade de malha na câmara de perfusão do microscópio. Ancore a fatia do cérebro com uma harpa de platina. Gire a grade de malha para que a linha de contatos do eletrodo na extremidade distal da sonda multicanal fique aproximadamente perpendicular à superfície PL.

Sob iluminação de campo amplo e controle preciso do micromanipulador, abaixe a sonda multicanal em direção à superfície da fatia. Engate o cubo de filtro apropriado para visualização da proteína repórter fluorescente expressa nos terminais axônicos das aferências corticais.

Se necessário, gire a fatia para alinhar com mais precisão a sonda com a superfície PL. Posicione a sonda logo acima do plano da fatia, 200 micrômetros abaixo da posição final do alvo ao longo do eixo x, deixando pelo menos um canal fora da área de tecido que está sendo registrada. Lentamente, insira a sonda na fatia ao longo de seu eixo longitudinal.

Para minimizar os danos ao tecido, avance a sonda apenas até o ponto em que as pontas afiadas fiquem visíveis abaixo da superfície do tecido. Mude a fonte experimental de ACSF para a solução de controle ensacada e identifique a célula marcada com fluorescência para gravação de patch-clamp direcionada. Restrinja a abertura ao menor diâmetro e acione a objetiva de imersão em água de alta potência, tomando cuidado para evitar o contato entre a sonda multicanal e a lente objetiva. Coloque o tecido em foco.

Centralize a luz sobre uma área de tecido adjacente, mas não sobreposta, à sonda multicanal. Ativar o conjunto de filtros adequado para permitir a obtenção de imagens das células que expressam o marcador fluorescente dependente de Cre. Levante a lente objetiva para criar amplo espaço para abaixar uma pipeta de remendo.

Carregue uma pipeta de remendo com solução interna e montada no porta-eletrodos. Use uma seringa de um mililitro para aplicar pressão positiva correspondente a aproximadamente 0,1 mililitro de ar. Abaixe a pipeta de adesivo na solução, focando a ponta sob orientação visual, e obtenha o registro de células inteiras da célula alvo.