JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:45 min • July 8th, 2025
Coloque uma fatia da medula espinhal de rato em uma câmara de gravação e prenda-a com uma âncora de tecido.
Perfunda a fatia com líquido cefalorraquidiano artificial.
Sob um microscópio, identifique a substância gelatinosa translúcida ou a região SG e selecione um neurônio SG saudável.
Posicione uma pipeta de adesivo cheia de uma solução iônica perto do neurônio.
Aplique uma leve pressão positiva para remover quaisquer detritos da ponta da pipeta.
Mova a pipeta em direção ao neurônio.
Em seguida, libere a pressão positiva para formar uma covinha na membrana neuronal, criando uma vedação.
Altere o potencial de retenção para aproximá-lo do potencial de membrana em repouso, ou RMP.
Use uma breve sucção para romper a membrana, estabelecendo uma configuração de célula inteira.
No RMP, aplique pulsos elétricos despolarizantes.
Esses pulsos abrem canais de sódio dependentes de voltagem, permitindo um rápido influxo de íons de sódio.
Esse influxo de íons desencadeia um potencial de ação, resultando no disparo de neurônios.
Registre os padrões de disparo dos neurônios.
Para realizar gravações de patch-clamp de células inteiras de neurônios da substância gelatinosa ou SG, use soluções intracelulares à base de íons de potássio para registro, enquanto aplica solução à base de cátion de césio apenas para o registro de correntes pós-sinápticas inibitórias.
Mova suavemente a fatia da medula espinhal para a câmara de gravação e, em seguida, estabilize-a firmemente com um fio de platina em forma de U com fios de nylon, para obter a estabilidade ideal da fatia. Perfunda constantemente a fatia com ACSF borbulhado à temperatura ambiente e defina a taxa de perfusão em 2 a 4 mililitros por minuto para obter oxigenação suficiente.
Em seguida, usando uma lente de microscópio de baixa resolução, identifique a região dos neurônios SG como uma banda translúcida. Escolha um neurônio saudável, caracterizado por uma forma tridimensional com uma membrana brilhante e lisa, como célula-alvo, usando a objetiva de alta resolução, e ajuste-o ao centro da tela do monitor de vídeo.
Encha uma micropipeta com um volume apropriado de solução intracelular à base de íons potássio ou à base de íons de césio. Em seguida, insira a micropipeta no porta-eletrodo e certifique-se de que a solução intracelular esteja em contato com o fio prateado dentro do porta-eletrodo. Coloque a micropipeta em foco e use o micromanipulador para mergulhá-la no ACSF. Aplique uma leve pressão positiva para forçar a remoção de qualquer sujeira e detritos.
Mova gradualmente a micropipeta em direção ao neurônio alvo. Assim que a pipeta se aproximar do neurônio e uma covinha muito pequena se formar na membrana neuronal, libere a pressão positiva para formar um gigaseal. Altere o potencial de retenção para menos 70 milivolts, que é próximo ao potencial fisiológico de membrana em repouso de uma célula.
Em seguida, aplique uma sucção transitória e suave à micropipeta para romper a membrana e criar uma boa configuração de células inteiras. Registre as propriedades de disparo testando o padrão de disparo de cada neurônio no grampo de corrente com uma série de pulsos de corrente despolarizante de um segundo de 25 a 150 picoamperes com incrementos de 25 picoamperes no potencial de membrana em repouso.