Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:18 min. • July 8th, 2025
Comece com um pavilhão auricular de rato dissecado, ou ouvido externo, com os nervos conectados expostos.
Insira o nervo destinado ao registro no eletrodo de registro.
Remova a camada de gordura perto da margem do pavilhão auricular para expor a base do folículo piloso e, em seguida, dobre a pele para expor os pelos para estimulação.
Posicione uma sonda de estimulação mecânica para tocar e desviar os cabelos.
Essa estimulação ativa as terminações nervosas sensoriais, abre canais iônicos controlados mecanicamente, permite o influxo de íons positivos e gera potenciais de ação.
Os potenciais de ação se propagam através dessas terminações para o nervo que está sendo registrado. Visualize o sinal.
Em seguida, adicione uma tintura fluorescente e continue a estimulação do cabelo.
O corante se liga às membranas neuronais estimuladas e é internalizado via endocitose sem afetar a atividade neuronal.
Pós-estimulação, lave para remover o corante não ligado.
Adicione um agente sequestrante para remover o corante ligado à membrana não internalizado.
Usando microscopia de fluorescência, visualize a coloração nos folículos pilosos para identificar terminações nervosas estimuladas mecanicamente.
Para fazer registros controlados de potenciais de ação evocados por estímulos, use uma sonda mecânica de vidro de microeletrodo de borossilicato de 10 centímetros polido a fogo conectado a um atuador piezoelétrico de cerâmica. Posicione a sonda de forma que ela se mova paralelamente à dobra da pele e toque os pelos, não a pele. Coloque-o cerca de meio a um milímetro acima da superfície da pele. Em seguida, verifique manualmente a estimulação ouvindo a saída de áudio quando a sonda se move.
Agora, configure o software para impulsionar a estimulação mecânica de uma pequena área de cabelos. Por exemplo, programe estimulações de três segundos em cinco sinusóides Hertz a cada 10s. Isso requer um deslocamento da sonda entre 200 e 2000 mícrons. Em seguida, prossiga usando estimulação automatizada repetida para verificar a consistência das respostas registradas nos nervos. Resultados repetíveis devem ser alcançáveis.
Quando os resultados forem consistentes, diminua a taxa de repetição para a cada 30s. Mais instruções são fornecidas no protocolo de texto. Para investigar as propriedades dos canais mecanossensoriais e rotular os terminais mecanosensoriais ao redor dos folículos pilosos, adicione 10 micromolares FM143 à solução e deixe por 60 minutos, enquanto continua a estimular os cabelos com a sonda oscilante.
Este corante bloqueia os canais transdutores candidatos em neurônios sensoriais em cultura e em células ciliadas da cóclea. No entanto, não bloqueia o disparo em aferentes de folículos pilosos maduros in situ. A rotulagem das terminações mostra que o corante atua como terminais, que continuam a responder à estimulação mecânica durante a exposição ao corante.