Inibição de correntes pós-sinápticas excitatórias mediada por microRNA em fatias de hipocampo de camundongo

Pegue fatias de cérebro de hipocampo de camundongo contendo neurônios CA3 infectados com um vetor viral recombinante.

O genoma viral expressa um canal ativado por luz marcado com um repórter fluorescente e um microRNA que regula negativamente a expressão de canais de cálcio dependentes de voltagem.

Coloque uma fatia em uma câmara de gravação em condições escuras. Usando um microscópio, identifique os neurônios CA3 fluorescentes.

Aplique um eletrodo de gravação em um neurônio CA1 que recebe entrada de neurônios CA3 infectados. Rompa a membrana para registrar correntes iônicas intracelulares.

Aplique um inibidor para bloquear os receptores de neurotransmissores inibitórios, permitindo apenas sinais excitatórios.

Usando pulsos de luz, estimule os canais ativados por luz nos neurônios CA3 infectados, gerando potenciais de ação.

Em camundongos não infectados, o potencial de ação ativa canais de cálcio dependentes de voltagem, causando um influxo de íons de cálcio que desencadeia a liberação de neurotransmissores. Os neurotransmissores desencadeiam correntes pós-sinápticas excitatórias, ou EPSCs, nos neurônios CA1.

Em camundongos infectados, a redução mediada por microRNA dos canais de cálcio dependentes de voltagem resulta na inibição do EPSC.

Para este protocolo, use um animal que 15 dias antes ou mais, teve rAAV1/2 injetado no cérebro, de acordo com um protocolo publicado anteriormente pela Cetin e companhia. Isole o cérebro e faça fatias agudas de cérebro com um vibratomo e aCSF gelado gaseado.

Colete as fatias da região de interesse e minimize sua exposição à luz para evitar a ativação da sonda optogenética. Deixe as fatias se recuperarem por 30 minutos a 37 graus Celsius no mesmo aCSF. Use uma câmara projetada especificamente para segurar fatias de cérebro. Em seguida, retorne as fatias à temperatura ambiente, onde permanecerão saudáveis por seis a oito horas.

Para prosseguir, transfira uma fatia para a câmara de registro e superfunda-a a dois mililitros por minuto de aCSF. Em seguida, verifique brevemente o sinal do repórter fluorescente expresso para verificar a localização e a intensidade da infecção. Em seguida, encha um eletrodo de remendo com a solução intracelular.

Agora, sob iluminação infravermelha, obtenha uma configuração de célula inteira bem fechada em um neurônio que está recebendo entradas sinápticas dos neurônios infectados. A resistência em série pode ser deixada sem compensação, mas deve ser constante e baixa. Por exemplo, se os neurônios piramidais CA3 foram infectados, remende os neurônios piramidais no trato proximal ao medial da região CA1.

Quando as células começam a parecer encolhidas ou inchadas, quando o remendo se torna difícil ou os remendos são instáveis, as fatias selecionadas não são saudáveis o suficiente para serem gravadas.

Em seguida, use a farmacologia para isolar as correntes sinápticas sob investigação. Por exemplo, se o objetivo é investigar a transmissão sináptica excitatória, bloqueie a transmissão sináptica inibitória adicionando bicuculina ao banho.

Em seguida, evoque correntes sinápticas, como correntes pós-sinápticas excitatórias, usando um laser azul de 473 nanômetros acoplado a uma fibra óptica posicionada na somata dos neurônios infectados. Não direcione o laser para os axônios do neurônio.

Por exemplo, evite iluminar as garantias de Schaffer. A despolarização direta dos axônios não é desejável. Em seguida, ajuste a duração da estimulação ao mínimo para reduzir a possibilidade de evocar mais de um potencial de ação por pulso de luz.

Em seguida, refine a intensidade do laser para evocar uma corrente sináptica pequena, mas claramente detectável. Por exemplo, para transmissão sináptica excitatória entre neurônios piramidais CA3 e CA1, ajuste a intensidade do laser para evocar correntes sinápticas de 20 a 50 picoamperes.