Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:31 min. • July 8th, 2025
Comece com uma configuração de eletrofisiologia contendo uma mosca transgênica imobilizada com um cérebro exposto.
Posicione uma micropipeta de registro perto de um neurônio pós-sináptico conectado a um neurônio pré-sináptico que co-expressa canais de sódio resistentes à tetrodotoxina e canais sensíveis à luz vermelha, e um interneurônio com canais de sódio sensíveis à tetrodotoxina.
Aplique sucção leve na micropipeta para formar uma vedação hermética com a membrana neuronal.
Em seguida, aplique uma forte sucção para romper a membrana.
Mantenha um potencial celular constante. Introduzir tetrodotoxina, que bloqueia os canais de sódio no interneurônio, impedindo a transmissão do sinal do interneurônio para o neurônio pós-sináptico.
No entanto, os canais de sódio resistentes à tetrodotoxina permanecem inalterados, permitindo que os íons de sódio entrem no neurônio pré-sináptico.
Ilumine a mosca com os pulsos de luz vermelha.
Isso estimula os canais sensíveis à luz, permitindo que os cátions influam e ativem o neurônio pré-sináptico.
Este neurônio pré-sináptico transmite diretamente um sinal para o neurônio pós-sináptico sem envolver o interneurônio, e a atividade elétrica resultante confirma a conexão monossináptica.
Na plataforma, comece imediatamente a perfundir a preparação com solução salina de registro borbulhada com carbogênio. Use um reservatório de solução salina alimentado por gravidade colocado acima do microscópio stage. Para coletar a solução salina residual, use uma linha de vácuo em um frasco de dois litros.
Em seguida, carregue a pipeta com quatro microlitros de solução de registro interna e conecte a pipeta a um micromanipulador. Em seguida, zere o deslocamento do amplificador e defina o amplificador para fornecer pulsos de teste. Em seguida, ajuste a iluminação oblíqua IR para obter uma visão clara do cérebro.
Agora, enquanto aplica pressão positiva à pipeta, aproxime-se da célula com a pipeta. Quando o contato com a célula for feito, libere a pressão positiva para selar a pipeta na membrana. Em seguida, defina o potencial de retenção da membrana para -60 milivolts e a pipeta deve formar uma vedação de gigaohm com a membrana celular. A corrente de retenção deve cair para um nível baixo de sub-picoamperes.
Para obter selos constantes de gigaohm, certifique-se de manter sua pipeta limpa, mantendo a pressão positiva, e evite bater no tecido ao se aproximar de suas células.
Para continuar, configure o amplificador para fornecer pulsos de teste de -50 a -60 milivolts. Os pulsos de teste revelarão um grande transiente capacitativo representando a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Para remover transientes capacitativos, ajuste os botões de compensação de capacidade no amplificador.
Agora, aplique breves pulsos de pressão negativa para romper a membrana celular e obter a configuração de toda a célula. Um grande aumento nos transientes capacitativos indica sucesso. Um pequeno aumento na corrente de retenção também deve ser observado. Em seguida, defina o amplificador para o modo de pinça de corrente e ajuste o potencial da célula entre -50 e -60 milivolts.
O potencial de retenção pode ser ajustado para enfatizar as conexões excitatórias ou inibitórias de acordo. Uma vez verificada a conexão, configure a perfusão salina para recirculação da solução salina. Defina as bombas para que o nível de solução salina no banho permaneça estável.
Em seguida, adicione tetrodotoxina suficiente ao sistema para uma concentração final de um micromolar. Isso deve interromper a atividade de pico do neurônio corrigido. Caso contrário, adicione mais tetrodotoxina ao sistema. Agora, aplique breves pulsos de luz vermelha para ativar o que provavelmente é uma conexão monossináptica.