Registrando correntes sinápticas na junção neuromuscular larval de Drosophila

Coloque uma placa de Petri contendo uma larva de Drosophila dissecada com músculos expostos e ramos nervosos no estágio do microscópio.

Insira um eletrodo de referência em uma solução de banho dentro da placa de Petri.

Encha um eletrodo de registro com uma solução isotônica.

Usando um micromanipulador, posicione este eletrodo sobre um músculo abdominal inervado por neurônios motores.

Coloque a ponta do eletrodo em um botão sináptico, uma estrutura na ponta do axônio contendo neurotransmissores.

Registre continuamente correntes juncionais excitatórias em miniatura ou mEJCs, que são respostas à liberação espontânea de neurotransmissores.

A faixa correta de amplitude mEJC confirma o posicionamento adequado do eletrodo.

Em seguida, posicione um eletrodo de estimulação próximo ao axônio que inerva o músculo alvo.

Aplique pressão negativa para puxar o axônio dentro do eletrodo.

Aumente gradualmente a corrente de estimulação para induzir um potencial de ação.

Isso aciona o axônio para liberar neurotransmissores na junção neuromuscular, que são registrados como correntes sinápticas.

Coloque a placa de Petri com a preparação no microscópio stage. Insira o eletrodo de referência no banho. Encha o eletrodo de registro com solução HL3. Sob a objetiva 10x, mergulhe o eletrodo no banho e coloque-o sobre os músculos seis e sete dos segmentos abdominais 2, 3 ou 4 usando o micromanipulador.

Em seguida, mude a objetiva para 60X e concentre-se na área de interesse usando epiflorescência ou óptica DIC. Coloque a ponta do eletrodo em cima dos botões sinápticos e, em seguida, pressione o eletrodo muito suavemente no músculo, pois a pressão excessiva pode danificar a JNM ou induzir um aumento na atividade sináptica espontânea.

Em seguida, ligue o amplificador, a placa AD e o computador. Em seguida, escolha o voltage clamp modo no amplificador. Inicie o software de aquisição e escolha o modo sem lacunas e observe a aparência dos mEJCs na tela do computador. Certifique-se de que a amplitude dos mEJCs esteja na faixa de 0,2 a 0,7 nanoamperes.

Usando um micromanipulador sob controle visual, coloque o eletrodo de estimulação próximo ao axônio que inerva os segmentos abdominais 2 a 4. Aplique pressão negativa puxando o pistão da seringa conectada ao porta-eletrodo, de modo que o axônio seja puxado para dentro do eletrodo.

Em seguida, ligue o estimulador. Gire o botão da unidade de isolamento para definir uma corrente zero e, em seguida, aumente-a suavemente até que os EJCs apareçam ou até que o limite seja atingido. Realizar a estimulação em regime supraliminar, com a corrente de estimulação aumentada aproximadamente duas vezes em relação ao limiar para a observação de EJCs.