Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:43 min. • July 8th, 2025
Comece com células endoteliais vasculares cerebrais ou CVE em meios de cultura.
As células CVE são células de alta demanda de energia que revestem os vasos sanguíneos do cérebro e são essenciais para a fisiologia cerebral.
Coloque as células em uma placa de cultura de células de fluxo extracelular. Incubar para fixação celular.
Substitua os meios de cultura por meios de ensaio de fluxo extracelular que tenham o pH desejado.
Incubar sem dióxido de carbono para manter o pH.
Em seguida, pegue um cartucho sensor de fluxo extracelular, que inclui sensores e uma placa inferior.
Adicione uma solução de calibração à placa e incube sem dióxido de carbono para hidratar os sensores.
Esses sensores podem medir as mudanças na concentração de oxigênio no ambiente extracelular, indicativas de atividade mitocondrial.
Em seguida, carregue o cartucho em uma máquina bioanalyzer e calibre os sensores.
Substitua a placa inferior pela placa que contém as células.
Meça a função mitocondrial das células CVE.
Após o número apropriado de subculturas, semeie 1,6 x 104 células em 80 microlitros de meio completo por poço em uma placa de cultura de células de fluxo extracelular de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
No dia anterior ao ensaio de avaliação funcional mitocondrial, hidrate um cartucho sensor de fluxo extracelular com 150 microlitros de solução calibrante de fluxo extracelular e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono.
Na manhã seguinte, use a estação lavadora de placas para transformar o meio de cultura de células em meio de ensaio de fluxo extracelular de pH 7,0 e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono por 30 a 60 minutos. Quando as células estiverem equilibradas, carregue o cartucho hidratado no bioanalisador e clique no botão Iniciar para iniciar a calibração.
No final da calibração, clique no prompt Desbloquear cartucho para remover a placa inferior do cartucho e carregue a placa da célula e, em seguida, abra os dados file para obter os valores de taxa do bioanalisador para exportação para o arquivo de planilha.