Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:34 min. • July 8th, 2025
Pegue uma fatia coronal do órgão quimiossensorial vomeronasal de um camundongo transgênico que expressa neurônios sensoriais marcados com fluorescência.
O epitélio sensorial contém esses neurônios marcados, que são expostos ao lúmen conectado à cavidade nasal para detectar pistas químicas.
Prenda a fatia em uma câmara de imagem usando uma âncora de fatia.
Transfira a câmara para uma configuração de registro e fluxo de solução extracelular oxigenada para manter a viabilidade do tecido.
Posicione uma pipeta de perfusão perto da fatia para introduzir estímulos químicos e uma pipeta de gravação sobre os neurônios sensoriais.
Usando um microscópio de fluorescência, identifique os neurônios marcados.
Aplique pressão positiva para evitar o entupimento da pipeta e aproxime-se de um neurônio até que uma covinha se forme na membrana.
Mude para pressão negativa, puxando a membrana para dentro da pipeta.
Aplique sucção para romper a membrana e estabelecer continuidade com o citoplasma, chamada de patch clamp de célula inteira, permitindo a introdução de estímulos químicos e registrando os sinais eletrofisiológicos resultantes.
Transfira uma fatia VNO para a câmara de imagem e fixe a posição da fatia usando âncora de aço inoxidável com fio de 0,1 milímetro de espessura Não cubra a fatia de tecido com nenhum dos fios de fibra sintética. Em seguida, transfira a câmara de imagem para a configuração de gravação e superfunda continuamente a fatia com S2 oxigenado à temperatura ambiente.
Ajuste o capilar de sucção à superfície da solução para criar uma troca constante de solução de banho. Em seguida, ajuste o lápis de perfusão multi-barril 8 em 1 acima e perto da parte não sensorial da fatia VNO que contém o vaso sanguíneo. Em seguida, conecte o eletrodo de referência e a solução do banho usando a ponte de ágar em forma de L preenchida com cloreto de potássio 150 milimolar.
Em seguida, encha a pipeta de remendo com a solução de pipeta S4. Monte a pipeta sobre o eletrodo revestido de cloreto de prata conectado ao estágio da cabeça sem raspar o revestimento e prenda firmemente. Em seguida, aplique uma leve pressão positiva na pipeta antes de entrar no banho. Monitore a pipeta e certifique-se de que ela esteja entre quatro megaohms e 10 megaohms.
Visualize a fatia VNO com uma câmera CCD usando DIC otimizado para infravermelho e identifique células que expressam FPR-rs3-i-Venus ou neurônios marcados de forma semelhante usando iluminação de fluorescência e um cubo de filtro apropriado. Aproxime-se do corpo celular usando volantes para obter a máxima sensibilidade. Devido à pressão positiva, um pequeno amassado na membrana do soma celular torna-se visível, uma vez que a ponta da pipeta está próxima.
Em seguida, libere a pressão positiva e aplique uma leve pressão negativa para sugar a membrana celular, a fim de obter uma vedação de alta resistência de 1 a 20 giga-ohms. Em seguida, aplique uma sucção curta e suave para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de toda a célula.