Medição simultânea do cálcio intracelular e do potencial de membrana em um endotélio cerebral de camundongo

Pegue segmentos de uma artéria cerebral posterior de camundongo.

Incubar com uma solução enzimática para degradar a matriz tecidual, soltando as células.

Substitua a solução por um tampão e transfira um segmento para uma câmara de gravação.

Dissocie mecanicamente o tecido conjuntivo e as camadas de células musculares lisas, isolando o tubo endotelial subjacente.

Prenda o tubo, remova as camadas dissociadas e adicione um tampão fisiológico.

Colocar a câmara num sistema de registo com fluxo tampão contínuo.

Introduza um indicador fluorescente de cálcio que entra nas células endoteliais e, em seguida, insira um eletrodo de registro em uma célula.

Administre um medicamento que desencadeie o influxo de íons cálcio e induza a sinalização a jusante para liberação de cálcio do retículo endoplasmático.

O indicador se liga ao cálcio e, após a excitação, emite fluorescência.

O aumento do cálcio ativa os canais de potássio dependentes de cálcio, causando escoamento de potássio e alterando o potencial de membrana.

Registre simultaneamente as alterações no cálcio intracelular por meio do sinal fluorescente e do potencial de membrana usando o eletrodo.

Neste procedimento, prepare o aparelho de trituração usando um microscópio, uma câmera e uma platina de alumínio segurando uma câmara e micromanipuladores. Prenda uma microsseringa com um controlador de bomba adjacente ao stage e à amostra. Em seguida, preencha completamente uma pipeta de trituração com óleo mineral e prenda-a sobre o pistão da microsseringa.

Em seguida, usando a microsseringa com controlador de bomba, retire cerca de 130 nanolitros de solução de dissociação para a pipeta, garantindo a ausência de bolhas de ar. Em seguida, coloque os segmentos arteriais intactos em um mililitro de solução de dissociação com as concentrações necessárias de enzimas em um tubo de vidro de 10 mililitros.

Incube a 34 graus Celsius por 10 a 12 minutos para digestão parcial. Após a digestão, substitua a solução enzimática por 5 mililitros de solução de dissociação fresca. Usando uma pipeta de 1 mililitro, transfira um segmento para a câmara contendo a solução de dissociação à temperatura ambiente.

Em seguida, coloque a pipeta na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do vaso digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de 2 a 5 nanolitros por segundo no controlador da bomba para uma trituração suave. Enquanto visualiza através de uma ampliação de 100 a 200 vezes, retire e ejete o segmento arterial para dissociar as células musculares lisas enquanto produz um tubo endotelial.

Se necessário, use cuidadosamente uma pinça de ponta fina para separar a adventícia dissociada e a lâmina elástica interna do tubo endotelial. Confirme se todas as células musculares lisas estão dissociadas e que apenas as células endoteliais permanecem como tubo intacto.

Usando micromanipuladores, prenda cada extremidade do tubo endotelial na lamínula de vidro da câmara de superfusão usando pipetas de fixação de vidro borossilicato. Lave a adventícia dissociada e as células musculares lisas da câmara e substitua a solução de dissociação por dois milimolares de cloreto de cálcio PSS.

Transfira a plataforma móvel presa ao tubo endotelial para o microscópio de superfusão e equipamento experimental. Em seguida, use seis reservatórios limpos de 50 mililitros para entrega contínua de PSS e respectivas soluções de medicamentos durante o experimento.

Use a válvula de controle de fluxo em linha para definir manualmente a taxa de fluxo tão consistente quanto o fluxo laminar, combinando a alimentação do fluxo com a sucção a vácuo. Entregue PSS à câmara para a superfusão do tubo endotelial por pelo menos cinco minutos antes de registrar os dados de fundo e o carregamento do corante.

Para medir o potencial de membrana simultaneamente com a concentração de cálcio intracelular, puxe um eletrodo afiado e preencha-o com cloreto de potássio de dois molares para registrar a partir de células carregadas com corante Fura-2.

Para estudar o acoplamento intercelular via transferência de corante, preencha o microeletrodo com iodeto de propídio a 0,1% dissolvido em dois molares de cloreto de potássio. Em seguida, coloque o eletrodo sobre um fio de prata revestido com cloreto no porta-pipetas preso a um estágio de cabeça de eletrômetro preso com um micromanipulador.

Use o micromanipulador para posicionar brevemente a ponta do eletrodo no PSS que flui na câmara enquanto visualiza através da objetiva de quatro vezes. Em seguida, defina o potencial de membrana em repouso para zero, conforme consistente com o potencial de banho aterrado.

Se desejar, use monitores de linha de base audíveis vinculados a eletrômetros para associar o tom do som a possíveis gravações. Depois, aumente a ampliação para 400 vezes usando uma objetiva de 40 vezes e posicione a ponta do eletrodo logo acima de uma célula do tubo endotelial.

Ajuste a janela fotométrica usando o software de fotometria para focar em cerca de 50 a 80 células endoteliais. Em seguida, coloque suavemente o eletrodo em uma das células do tubo endotelial usando o micromanipulador e aguarde pelo menos dois minutos para que o potencial de membrana em repouso se estabilize.

Uma vez que o potencial de membrana em repouso esteja estável em seu valor esperado, ligue o tubo fotomultiplicador na interface de fluorescência na ausência de luz e inicie a aquisição da concentração de cálcio intracelular excitando Fura-2, alternadamente, a 340 e 380 nanômetros enquanto coleta a emissão de fluorescência a 510 nanômetros.

Uma vez estabelecidas as medições simultâneas do potencial de membrana e da concentração de cálcio intracelular, aguarde cerca de cinco minutos para a superfusão do tubo endotelial com PSS a uma taxa de fluxo laminar constante antes da aplicação dos medicamentos.

Aplique o medicamento preparado em PSS na câmara de superfusão a uma taxa de fluxo constante. Durante o tratamento medicamentoso, meça o potencial de membrana na proporção F340 / F380 simultaneamente. Uma vez feito o experimento, retire o eletrodo da célula. Em seguida, interrompa os respectivos registros do potencial de membrana e da concentração de cálcio intracelular e salve os arquivos para análise de dados.