Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

O objetivo geral deste procedimento é investigar a regeneração da raiz dorsal para descobrir um meio de induzir regeneração significativa após lesões na raiz espinhal. Isso é feito criando primeiro uma hemilaminectomia espinhal que expõe a raiz dorsal L cinco direita e permite a visualização de axônios positivos marcados com YFP na medula espinhal e na raiz dorsal. Em seguida, a raiz dorsal L five é esmagada cuidadosamente para garantir o mínimo de sangramento.

O local do esmagamento é então visualizado após o esmagamento para verificar a posição da raiz dorsal lesionada na lesão. Ao longo de vários pontos de tempo, o local da lesão e a zona de entrada da raiz dorsal são fotografados para determinar a capacidade dos axônios danificados de se regenerar na medula espinhal. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que os axônios em regeneração são rapidamente imobilizados e permanecem estacionários ao entrarem na zona de entrada da raiz dorsal ou DREZ.

A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como imagens em um animal morto, é que podemos obter imagens desse sistema em um animal vivo repetidamente durante um período de semanas ou até meses. Primeiro, coloque uma almofada de aquecimento controlada termostaticamente sob um microscópio estéreo fluorescente e ajuste a saída para 32,5 graus Celsius em uma almofada de aquecimento, ajustada para 32,5 graus Celsius solução de campainha estéril pré-aquecida para 32,5 graus Celsius para irrigação da medula espinhal Durante a cirurgia, anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de um coquetel de xilazina e cetamina. Uma dose inicial do analgésico buprenorfina também é administrada por via subcutânea.

Um nível adequado de anestesia é alcançado quando o reflexo palpável está ausente e o animal não responde a um beliscão do dedo do pé. Assim que a anestesia for confirmada, raspe a parte superior das costas com uma tesoura para pequenos animais e espalhe uma pequena gota de loção depilatória sobre a área depilada com cotonetes. Minutos depois, remova a loção aplicada e qualquer pelo restante com água e sabão.

Finalmente, usando esponjas de gaze embebidas em etanol 70% para limpar completamente o campo cirúrgico. Coloque o animal na almofada de aquecimento e desinfete a pele com cotonetes embebidos em etanol a 70%. Um campo cirúrgico estéril deve ser aplicado para fins de demonstração.

Não é mostrado neste vídeo. Sob iluminação de campo claro no microscópio estéreo, faça uma incisão na linha média de dois a três centímetros na pele das costas. Se necessário, use cotonetes com ponta de algodão para parar o sangramento.

Reflita a musculatura espinhal com pinças finas e mandíbulas ósseas. Para expor as vértebras lombares subjacentes. Exponha os segmentos espinhais L três a S um por hemilaminectomia do lado direito usando jurados pequenos e depois perfunda a cavidade com solução de ringer estéril quente.

Posicione o animal em uma almofada de apoio feita de gaze de algodão enrolada. Para achatar a coluna vertebral. Use ganchos de retração para ampliar a área exposta.

Neste momento, aproximadamente 30 minutos após a primeira injeção do anestésico, um suplemento deve ser injetado para manter o animal totalmente anestesiado. Mude para excitação fluorescente para visualizar por que os axônios marcados com FP. Usando a ponta de uma agulha de calibre 27 e meio, faça uma pequena incisão na dura-máter que cobre a perfusão da raiz dorsal L cinco repetidamente com solução de ringer e limpe suavemente com cotonetes com ponta de algodão.

Identifique o local a ser triturado e capture imagens de toda a área exposta e não danificada. Isso ajudará a identificar o local da lesão em sessões de imagem subsequentes. Em seguida, insira um lado de um par de pinças finas.

Feche devidamente a pinça com cuidado, mas com firmeza, segurando a porção medial da raiz L cinco por 10 segundos e, em seguida, solte suavemente a pinça. Lave repetidamente com solução fisiológica e limpe suavemente com cotonetes. Obtenha várias imagens de toda a área exposta, incluindo o local do esmagamento e o DREZ antes e logo após o esmagamento em baixa e alta ampliação.

Depois de obter imagens firmes, aplique um pedaço de membrana fina de matriz sintética seguida de dura-máter artificial no topo da medula espinhal exposta, de modo que eles se encaixem precisamente na janela exposta da medula espinhal. Feche a musculatura com suturas estéreis de cinco oh e feche a incisão da linha média com clipes de ferida. Injete soluções de ringer por via subcutânea e administre buprenorfina como analgesia pós-operatória por injeção intramuscular a cada 12 horas por dois dias.

Anestesie o animal com xilazina e cetamina conforme descrito anteriormente e remova os clipes e suturas da ferida. Remova a dura-máter artificial e os adesivos finos de membrana de matriz sintética e mantenha-os em um tubo estéril contendo solução de ringer para reutilização posterior. Em seguida, remova suavemente qualquer tecido cicatricial conjuntivo acumulado com a ponta dobrada de uma agulha de calibre 26 e pinças finas perfundindo frequentemente com solução de campainha quente.

Reexponha o campo operatório, incluindo o local do esmagamento e a zona de entrada da raiz dorsal, e reposicione os axônios marcados com YFP fotografados em sessões anteriores para imagens contínuas durante a regeneração. Aqui, quatro axônios superficiais marcados com YFP indicados por setas coloridas são mostrados imediatamente após o esmagamento. Três dias após o esmagamento, todos os quatro axônios estendem um único neurite que cresce através do local do esmagamento, conforme destacado em dois cinco dias após o esmagamento.

Os neuritos permanecem estáveis e não há crescimento adicional desses ou de outros axônios proximais. No quarto dia, os neuritos em regeneração são mais finos e mais escuros do que os axônios poupados. Imagens repetidas desses axônios em suas pontas a cada dois ou três dias por mais duas semanas revelam que eles não cresceram para frente ou se retraíram, mas permaneceram imóveis com inchaço das pontas e eixos de alguns axônios.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expor, esmagar e observar a raiz L five do para entender melhor os mecanismos que proíbem ou promovem a regeneração axonal.