Registro de potenciais pós-sinápticos excitatórios do campo neuronal em fatias agudas do hipocampo

Coloque uma fatia do hipocampo do camundongo em uma câmara de submersão cheia de líquido cefalorraquidiano artificial, ou aCSF.

Prenda a fatia com uma malha de retenção para evitar movimentos.

Circule continuamente o aCSF oxigenado para manter a viabilidade neuronal.

Instale eletrodos de referência para fornecer uma referência de tensão estável.

Posicione os eletrodos de estimulação e registro alinhados e paralelos ao estrato CA1 piramidal do hipocampo.

Aplique pulsos elétricos.

Esses pulsos estimulam os neurônios, fazendo com que os canais iônicos dependentes de voltagem se abram, permitindo que íons positivos fluam e desencadeando potenciais de ação.

Esses potenciais de ação se propagam ao longo dos neurônios e induzem a liberação de neurotransmissores excitatórios na fenda sináptica.

Os neurotransmissores se ligam a receptores específicos nos neurônios pós-sinápticos, permitindo o influxo de íons positivos e resultando em uma mudança no potencial de membrana - o potencial pós-sináptico excitatório, ou EPSP.

O eletrodo de gravação mede o EPSP de uma população de neurônios dentro da região de registro - o campo EPSP.

Mergulhe previamente um pequeno pedaço de papel de limpeza de lentes e uma malha de náilon fixada em um fio de platina em forma de U na câmara de submersão por alguns minutos. Depois disso, remova o fio de platina em forma de U. Desligue a reciclagem e coloque uma fatia no papel de limpeza da lente. Em seguida, coloque imediatamente a malha de suporte da fatia em cima da fatia.

Ligue a bomba e deixe a fatia se equilibrar por 30 minutos sem mergulhar a objetiva no ACSF. Enquanto isso, encha o eletrodo de gravação com ACSF e monte-o no porta-pipeta.

Em seguida, coloque o eletrodo de estimulação de tungstênio isolado com epóxi testado no suporte do manipulador e o fio de referência na câmara de fatia. Adicione um segundo eletrodo de referência à câmara e conecte-o ao soquete de referência do estágio principal do eletrodo de registro.

No software de controle do amplificador, clique na caixa Modo de grampo zero e, em seguida, clique duas vezes na caixa Lista de ganho de saída. Escolha um ganho de 100. Clique duas vezes na caixa de filtro passa-alta abaixo. Escolha 3 kilohertz e clique duas vezes na caixa de listagem de filtro passa-baixa AC para escolher 0,1 hertz.

No software de gravação, clique em Adquirir Protocolo Aberto. Escolha um protocolo que tenha as configurações que permitem estímulos episódicos e a digitalização de potenciais amplificados de 10 a 20 kilohertz por 50 a 100 milissegundos, e que acione automaticamente um isolador de estímulo 10 milissegundos após o início de uma gravação episódica.

Colocar os eléctrodos de estimulação e de registo alinhados e paralelos ao estrato piramidal. Em seguida, clique em Adquirir Editar Protocolo e escolha a guia Gatilho na janela pop-up. Clique na caixa Fonte do gatilho e escolha a barra de espaço como a fonte do gatilho. Em seguida, clique no botão OK e clique no botão Gravar para iniciar a aquisição.

No software isolador de estímulo, clique na caixa de controle de tensão e digite zero. Clique no botão Download. Em seguida, clique na janela Software de gravação e pressione a barra de espaço. Repita esse ciclo inserindo sequencialmente valores de 1.000 a 8.000. Correlacione a força de estimulação com os valores de inclinação do FEPSP e determine a força de estimulação necessária para obter 40% do máximo de inclinação do FEPSP. Clique na caixa Controle de tensão e insira o valor determinado. Em seguida, clique no botão Download.

No software de gravação, clique no botão Parar e, em seguida, no menu Adquirir. Clique em Editar protocolo e escolha a guia Gatilho na janela pop-up. Depois, clique na caixa Fonte do gatilho e escolha o Temporizador interno como fonte do gatilho. Clique no botão OK, seguido do botão Gravar que inicia a gravação automática de potenciais de campo a cada 60 segundos. Clique no botão Parar após 30 a 60 minutos.

No software de gravação, clique em Adquirir protocolo aberto e escolha o mesmo protocolo da gravação de linha de base. Clique no botão OK e, em seguida, clique em Gravar. Continue executando automaticamente as gravações de potencial de campo por duas a quatro horas. Quando terminar, clique no botão Parar para encerrar a gravação.