Detecção de respostas fisiológicas de neurônios sensoriais em Drosophila

Prenda uma Drosophila melanogaster geneticamente modificada anestesiada de lado a uma lamínula.

Estenda as patas dianteiras e prenda-as para expor os segmentos do tarso.

Esses segmentos têm neurônios gustativos que expressam complexos indicadores de cálcio que fluorescem na forma ligada ao cálcio.

Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor da mosca para reter a solução.

Deixe a mosca se recuperar e sobreponha uma solução salina tamponada nos segmentos tarsais expostos para umedecê-los.

Sob um microscópio confocal, observe os segmentos do tarso e a imagem dos neurônios gustativos em várias profundidades para obter uma fluorescência de pré-estimulação.

Adicione uma solução de estimulação contendo ligantes lipofílicos no segmento.

Esses ligantes se ligam aos receptores dos neurônios gustativos, iniciando vias de sinalização e desencadeando a abertura dos canais de cálcio.

Isso permite que os íons de cálcio do fluido extracelular entrem no citoplasma e se liguem aos complexos indicadores de cálcio, resultando na emissão de fluorescência.

Quando observado novamente, um aumento na fluorescência neuronal confirma a resposta fisiológica neuronal ao ligante.

Depois de anestesiar a mosca, prenda-a a uma lamínula de 0,17 milímetros, usando uma gota bem pequena de esmalte transparente. Prenda o lado da braguilha ao slide usando a gota inteira. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use um pincel úmido para estender uma perna dianteira da mosca. Em seguida, usando duas tiras muito finas de fita, prenda o primeiro e o quinto segmentos do tarso na lamínula.

Se os neurônios da tromba forem fotografados, coloque outra tira fina de fita adesiva sobre o rostro da tromba para expor o labelo. Agora, faça uma mureta ao redor da mosca usando uma caneta PAP. Deixe a anestesia passar por meia hora antes de fazer as medições. Para este protocolo, preparar as diluições necessárias da solução de ligante de reserva de 1 miligrama por mililitro utilizando PBST.

Para iniciar o procedimento, sobreponha 10 microlitros de PBST nos segmentos tarsais seguros e expostos. Isso umedece a perna e evita que ela saia de foco. Em seguida, concentre-se nos segmentos usando um sistema óptico que possa obter um bom sinal de fluorescência com resolução de tempo rápida, como um microscópio confocal de disco giratório com uma câmera sCMOS. Colete três pilhas Z de pré-estimulação dos neurônios de interesse no segmento do tarso.

Neste exemplo, as imagens são capturadas com exposições de 200 milissegundos e um compartimento de 2 por 2 em uma seção de 6 mícrons por 1/2 mícron a cada dois segundos. Certifique-se de otimizar a potência do laser para minimizar o fotobranqueamento, enquanto ainda permite uma alta relação sinal-ruído. Aqui, um laser de 491 nanômetros e 100 miliwatts é operado com 30% de transmissão.

O sinal deve ser detectável antes da estimulação, mas não deve se aproximar da saturação. Agora, pipete 10 microlitros de solução de estimulação no segmento tarsal de interesse. Ao pipetar, tenha muito cuidado para evitar tocar na perna, ou em qualquer parte do corpo da mosca, ou o tarso sairá da posição. Em seguida, adquira imediatamente as primeiras imagens pós-estimulação e continue a coletar imagens suficientes para documentar a mudança máxima na fluorescência.