Carga e descarga de corante FM mediada por microeletrodo em células nervosas de larvas de Drosophila

Comece com larvas de Drosophila, com fibras musculares e nervosas expostas imersas em uma solução contendo vesículas de corante de membrana fluorescente ou corante FM.

O corante FM se liga aos lipídios na membrana celular, formando um revestimento fluorescente sobre ela.

Usando uma unidade micromanipuladora, posicione a ponta do microeletrodo de sucção sob um microscópio.

Concentre-se nas fibras nervosas e no microeletrodo.

Use pressão negativa para sugar uma alça da fibra nervosa para o microeletrodo.

Aplique pulsos de corrente para estimular a fibra nervosa.

Isso desencadeia a junção neuromuscular, onde um neurônio motor se conecta a uma fibra muscular, para iniciar a endocitose da vesícula sináptica.

Durante esse processo, a célula envolve a membrana revestida com corante FM para formar vesículas endocíticas coradas, ideais para visualizar estágios pré-sinápticos de neurotransmissão.

Lave o corante FM e substitua a solução externa.

Aplique pulsos de corrente para descarregar as vesículas coradas com corante FM para fora da célula.

Para estimulação elétrica, prepare uma pipeta de sucção usando o extrator de microeletrodo para obter a conicidade e o tamanho da ponta necessários. Depois, polir a ponta do microeletrodo com uma microforja para criar um ajuste firme ao sugar um único nervo motor.

Deslize a pipeta de sucção no porta-eletrodo em um micromanipulador, que é conectado a um tubo de plástico longo e flexível e a uma seringa. Em seguida, coloque a preparação com corante FM no estágio do microscópio e eleve o estágio até que a larva e a pipeta de sucção estejam em foco.

Em seguida, aspire um laço de nervo motor cortado, inervando o hemissegmento selecionado com pressão de ar negativa gerada pela seringa no eletrodo de sucção. Posteriormente, estimule o nervo motor usando os parâmetros selecionados para conduzir a endocitose SV e a captação do corante FM1-43.

A etapa mais crítica neste ponto do procedimento é sugar um único axônio motor para o eletrodo de sucção com um ajuste apertado. Isso pode levar algumas tentativas e erros. Assim que um eletrodo de sucção adequado for encontrado, use o mesmo para todas as condições que estão sendo comparadas para garantir uma força de estimulação consistente.

Para a descarga do corante FM, suga o mesmo nervo motor para o mesmo eletrodo e, em seguida, estimula o nervo motor a ativar a exocitose SV e a liberação do corante FM1-43.