Eletrofisiologia Optogenética Registro de Células com Canais Iônicos Dependentes de Luz

Coloque uma lamínula contendo células renais embrionárias que expressam canais iônicos dependentes de luz e uma proteína repórter fluorescente em uma câmara de medição aplicada com silício. Feche-o e adicione um buffer externo.

Posicione esta câmara sob um microscópio. Coloque um eletrodo de banho cheio de ágar. Perfunda com um tampão para remover meios residuais e células mortas.

Usando um filtro de fluorescência, identifique e concentre-se na célula-alvo.

Conecte uma pipeta de patch a um micromanipulador. Aplique pressão para evitar entupimento e aproxime-se da célula.

Posicione a pipeta perto da célula e libere pressão positiva para formar um adesivo de membrana na ponta.

Depois de formar o adesivo de membrana, aplique pressão negativa para romper a membrana.

Aplique uma luz de um comprimento de onda específico para abrir os canais iônicos. O movimento dos íons é registrado como mudança de tensão pelo eletrodo.

Para começar, sele a câmara de medição com silicone para evitar vazamento do tampão externo. Em seguida, coloque uma lamínula na câmara e feche-a. Encha a câmara cuidadosamente com tampão extracelular para evitar que as células se desprendam. Em seguida, coloque a câmara de medição sob o microscópio usando a objetiva de 40x para visualização celular.

Em seguida, coloque uma ponte de ágar sobre o eletrodo do banho e coloque-o na câmara junto com o sensor de nível de fluido e a saída de perfusão do manipulador de banho. Trocar a solução extracelular duas vezes por 1 mililitro de solução externa fresca para remover o meio de cultura residual e as células destacadas. Coloque as células em foco e procure uma célula transfectada, que precisa ser isolada de outras células. Em seguida, use um conjunto de filtros de banda tripla e luz laranja para excitar e visualizar mCherry.

Monte a pipeta no suporte da pipeta e aplique um pouco de pressão positiva para evitar o entupimento da ponta. Localize a ponta da pipeta de remendo sob o microscópio e navegue-a perto da célula usando o micromanipulador.

No software de aquisição de dados, inicie o teste de membrana no modo Bath e aplique um voltage passo. Verifique se a resistência da pipeta está na faixa desejada de 1,3 a 3,0 megaohms. Em seguida, zere as correntes de deslocamento e ajuste o potencial da pipeta girando o botão de deslocamento da pipeta no amplificador.

Para estabelecer um adesivo na configuração de toda a célula, aproxime-se lentamente da célula com a pipeta de adesivo por cima e libere a pressão positiva antes de tocar na célula. Compense a capacitância da pipeta girando o botão de compensação da capacitância da pipeta para obter uma resposta plana do pulso de teste.

Mude o teste de membrana para o modo Célula. Em seguida, rompa o remendo sem destruir a vedação aplicando pulsos curtos de pressão negativa ou pressão negativa com força crescente para obter a conformação de toda a célula.

Inicie a compensação de resistência em série definindo os dois parâmetros de célula inteira, capacitância da célula e resistência em série. Registre correntes induzidas por luz em diferentes potenciais de retenção. Esta figura mostra que durante a iluminação com luz verde, o PSACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária.