Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:11 min. • July 8th, 2025
Pegue os gânglios da raiz dorsal de ratos imobilizados, ou DRG, em uma câmara de registro perfundida com aCSF.
O DRG contém neurônios sensoriais cercados por células gliais satélites.
Aplique pressão positiva a uma pipeta cheia de solução intracelular e conectada a um amplificador e, em seguida, avance-a em direção ao neurônio-alvo.
A pressão positiva ajuda a atravessar a camada de células gliais satélites circundantes e entrar em contato com o neurônio, formando um recuo em sua membrana.
Aplique pressão negativa para formar uma vedação firme com a membrana.
Em seguida, aplique pulsos de pressão negativa para estabelecer a configuração de toda a célula. Calibre os parâmetros do amplificador para medições precisas do sinal.
Para determinar a excitabilidade do neurônio, aplique breves correntes incrementais no neurônio, abrindo os canais iônicos dependentes de voltagem e desencadeando um potencial de ação.
Meça a reobase, a corrente mínima necessária para desencadear um potencial de ação.
Além disso, aplique uma corrente de rampa para medir o potencial mínimo de membrana no qual o potencial de ação ocorre.
Neste procedimento, coloque a solução do eletrodo no gelo para evitar a degradação. Em seguida, encha a pipeta de vidro com solução intracelular filtrada. Em seguida, coloque a pipeta no suporte da pipeta do estágio principal.
Aplique uma leve pressão positiva na pipeta através de uma seringa de 5 mililitros, deslocando o êmbolo cerca de 1 mililitro antes de abaixar a pipeta na solução do banho. Em seguida, escolha o modo V-clamp no amplificador e abra a interface de teste de membrana no software.
Sob o microscópio, mova a pipeta para perto do neurônio alvo. Em seguida, aplique pressão positiva da pipeta para atravessar a camada de células gliais satélites até que seja observado um aumento repentino do espaço entre o neurônio e a camada circundante de células gliais satélites. Em seguida, continue movendo a pipeta em direção ao neurônio até que uma covinha seja observada no neurônio.
Em nossa preparação, os neurônios são cercados por células gliais satélites. Portanto, para penetrar nas camadas de células gliais e atingir neurônios individuais, a pipeta de registro é mantida a uma alta pressão positiva.
Depois disso, reduza a pressão positiva. Obtenha uma vedação de gigaohm com sucção suave.
Para obter a configuração de registro de células inteiras, penetre na membrana celular do neurônio por meio de sucção curta, mas forte.
Como alternativa, use a função zap no amplificador enquanto a sucção é aplicada.
Uma vez que um modo de célula inteira é estabelecido, compense a capacitância de célula inteira e a resistência em série girando os botões de compensação de capacitância e resistência no amplificador. Em seguida, feche a janela de teste de membrana. Escolha I-clamp modo normal girando o botão de modo no amplificador.
Depois, clique em Abrir protocolo no software. Selecione e carregue o protocolo para medir a reobase e clique em Gravar para iniciar a gravação. Para examinar a excitabilidade neuronal, meça a resistência de entrada e a reobase injetando uma série graduada de correntes despolarizantes em etapas de 100 picoamperes.