Avaliação de sinapses de fita em regiões de frequência específicas da cóclea de camundongo

Comece com tubos contendo voltas cocleares de camundongo pré-tratadas com um agente permeabilizante e um agente bloqueador que evitam interações inespecíficas.

Cada volta detecta diferentes frequências sonoras e contém células ciliadas que convertem o som em sinais elétricos. Esses sinais são transmitidos por meio de neurotransmissores em sinapses de fita para o nervo auditivo.

Remova a solução e adicione anticorpos primários que interagem com proteínas no cabelo e nas células nervosas nas sinapses da fita e, em seguida, lave.

Incubar com anticorpos secundários marcados com fluoróforos vermelhos e verdes, que se ligam aos seus anticorpos primários.

Lave para remover anticorpos secundários não ligados.

Coloque a amostra em uma lâmina de vidro com um meio de montagem contendo corante nuclear para manchar os núcleos de azul.

Monte a lamínula. Seque-o e use um microscópio confocal para obter imagens de cada segmento em várias profundidades.

As sinapses de fita aparecem como pontos vermelhos e verdes posicionados de perto.

Conte esses pontos funcionais em cada turno para correlacionar sua resposta à frequência do som.

Após a dissecção, coloque cada volta coclear em tubos de centrífuga individuais de 2,5 mililitros. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com soro de cabra a 10% em PBS em Triton X-100 a 0,1% por 1 hora em temperatura ambiente em um rotador.

No final da incubação, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para remover a solução sob um microscópio de dissecação. Incube as amostras com os anticorpos primários de interesse diluídos em 5% de soro de cabra em PBS e 0,1% de Triton X-100 durante a noite a 4 graus Celsius em um rotador.

Na manhã seguinte, enxágue as amostras de tecido três vezes por 5 minutos com PBS molar frio de 0,1 por lavagem para remover qualquer anticorpo primário residual. Em seguida, rotule as amostras com os anticorpos secundários apropriados diluídos em soro de cabra a 5% em PBS e Triton X-100 a 0,1% por duas a três horas em temperatura ambiente no rotador, protegido da luz.

No final da incubação, lave as amostras três vezes com PBS 0,1 molar, conforme demonstrado, e transfira as amostras para placas individuais de 35 milímetros contendo PBS 0,1 molar. Coloque uma gota de meio de montagem suplementado com DAPI na lâmina e transfira as amostras do PBS para o meio de montagem. Coloque uma ponta de uma lamínula em cada lâmina e solte para que as lamínulas caiam suavemente. Em seguida, seque as lâminas em uma caixa de lâminas a 4 graus Celsius durante a noite.

Para obter imagens das amostras, use um microscópio confocal com os lasers apropriados e uma lente de imersão em óleo de alta resolução de 63x. Adquirir pilhas z confocais de 8 micrômetros de cada volta da cóclea. Para contagens de pontos sinápticos, defina as pilhas z com o tamanho do passo de 0,3 micrômetro para abranger todo o comprimento das células ciliadas internas, garantindo que todos os pontos sinápticos possam ser visualizados, e mescle as imagens contendo pontos em uma pilha para obter a projeção do eixo z.

Importe as imagens mescladas para um programa de software de processamento de imagem apropriado. Divida as contagens totais sinápticas em cada pilha z em regiões de frequência específicas pelo número de células ciliadas internas positivas para DAPI para calcular o número de pontos sinápticos para cada célula. Em cada região de frequência específica, calcule a média de todos os pontos sinápticos em 3 imagens de diferentes campos microscópicos contendo 9 a 11 células ciliadas internas.

Para visualizar melhor a arquitetura do citoesqueleto e a localização sináptica, use a ferramenta pincel para avaliar visualmente a estrutura sináptica e a distribuição das células ciliadas internas individuais. Para inspecionar a justaposição de fitas pré-sinápticas e placas de receptores pós-sinápticos, use a ferramenta letreiro retangular para extrair o espaço de voxel ao redor das fitas e use o corte de imagem para isolar as fitas individuais. Em seguida, clique em Imagem e Tamanho da imagem para adquirir uma matriz de miniaturas dessas projeções em miniatura que podem ser usadas para identificar sinapses emparelhadas versus fitas órfãs.