Isolamento de Proteínas de Superfície Celular e Intracelulares de uma Cultura de Astrócito

Pegue uma cultura de astrócitos e remova o meio. Adicione um tampão fisiológico e incube no gelo, inibindo a endocitose das proteínas da superfície celular.

Incubar com um reagente de biotinilação que se liga às proteínas da superfície celular.

Em seguida, incube com um tampão de têmpera para inativar qualquer reagente que não tenha reagido.

Adicione um tampão fisiológico frio e separe mecanicamente as células. Transfira as células, centrifugue e descarte o sobrenadante.

Incube com um tampão de lise para lisar as células, liberando proteínas intracelulares biotiniladas e intracelulares não biotiniladas.

Centrifugar, recolher o sobrenadante e separar uma fracção com o teor total de proteínas.

Incubar a fração restante sob agitação com esferas revestidas de estreptavidina que se ligam às proteínas biotiniladas.

Gire para baixo as esferas ligadas às proteínas da superfície celular e separe o sobrenadante contendo proteínas intracelulares.

Lave as esferas sob agitação para remover proteínas não especificamente ligadas, depois centrifugue e descarte o sobrenadante, isolando as proteínas da superfície celular.

As frações contendo proteínas totais, intracelulares e de superfície celular estão prontas para análise.

Para iniciar este procedimento, remova as culturas de astrócitos da incubadora e descarte o meio por aspiração. Lave as células três vezes com 4 mililitros de CM-PBS resfriado e coloque os pratos em gelo picado.

Remova o CM-PBS por aspiração e, em seguida, pipete dois mililitros de tampão de biotina em cada poço. Incline suavemente os pratos para frente e para trás algumas vezes, para garantir uma cobertura completa antes de colocar as culturas no gelo por 30 minutos.

Depois, remova o tampão de biotina, substitua-o por quatro mililitros de tampão de têmpera e mantenha as culturas no gelo por 10 minutos. Em seguida, aspire e substitua com a mesma quantidade do tampão de têmpera antes de deixar as culturas no gelo por 10 minutos.

Em seguida, descarte o tampão de têmpera e lave as células três vezes com 4 mililitros de CM-PBS resfriado. Em seguida, raspe as células em um mililitro de CM-PBS resfriado e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga.

Em seguida, peletizar as células por centrifugação a 100 g por três minutos em uma microcentrífuga refrigerada ajustada para 4 graus Celsius. Depois disso, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de lise.

Em seguida, deixe as amostras no gelo por 30 minutos, agitando a cada cinco minutos. Em seguida, centrifugue o lisado a 14.000 g por 10 minutos a 4 graus Celsius para repelir qualquer detergente e materiais solúveis. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Economize 50 microlitros do lisado e adicione 25 microlitros de buffer de carregamento 3x a ele.

Posteriormente, desnature-o aquecendo a 95 graus Celsius em banho seco. Esta é a fração de entrada que contém proteínas biotiniladas da superfície celular, bem como proteínas citosólicas não biotiniladas. Usando uma ponta de pipeta cortada, transfira 75 microlitros de grânulos de estreptavidina agarose para o lisado e incube-o a 4 graus Celsius por três horas em um shaker.

Em seguida, pulverizar as esferas de estreptavidina agarose por centrifugação a 1.500 g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Economize 50 microlitros do sobrenadante e adicione 25 microlitros de buffer de carregamento 3x. Em seguida, desnature-o a 95 graus Celsius em banho-maria ou bloco de aquecimento. Isso representa a fração intracelular e é composto principalmente de proteínas citosólicas não biotiniladas.

Depois, ressuspenda as contas peletizadas em um mililitro de tampão de lavagem e balance-as por três minutos a 4 graus Celsius. Retire as contas e descarte o sobrenadante. Repita esse processo mais quatro vezes para minimizar a ligação inespecífica de proteínas citosólicas não biotiniladas.

Adicione 50 microlitros de tampão de carga diluído a 1x usando tampão de lise. Libere biotina e estreptavidina das contas desnaturando-as a 95 graus Celsius. Esta fração deve conter apenas proteínas de superfície celular biotiniladas.