Isolamento de Proteínas de Superfície Celular e Intracelulares de uma Cultura de Astrócito

Pegue uma cultura de astrócitos e remova o meio. Adicione um tampão fisiológico e incube no gelo, inibindo a endocitose das proteínas da superfície celular.

Incubar com um reagente de biotinilação que se liga às proteínas da superfície celular.

Em seguida, incube com um tampão de têmpera para inativar qualquer reagente que não tenha reagido.

Adicione um tampão fisiológico frio e separe mecanicamente as células. Transfira as células, centrifugue e descarte o sobrenadante.

Incube com um tampão de lise para lisar as células, liberando proteínas intracelulares biotiniladas e intracelulares não biotiniladas.

Centrifugar, recolher o sobrenadante e separar uma fracção com o teor total de proteínas.

Incubar a fração restante sob agitação com esferas revestidas de estreptavidina que se ligam às proteínas biotiniladas.

Gire para baixo as esferas ligadas às proteínas da superfície celular e separe o sobrenadante contendo proteínas intracelulares.

Lave as esferas sob agitação para remover proteínas não especificamente ligadas, depois centrifugue e descarte o sobrenadante, isolando as proteínas da superfície celular.

As frações contendo proteínas totais, intracelulares e de superfície celular e