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Comece com uma antena contendo uma matriz de silício que tenha vários canais pequenos conectados às portas de entrada e saída.
Injete a proteína de teste com atividade repulsiva através da entrada para preencher os canais.
Incube para permitir a aderência da proteína na área do canal, formando zonas de proteína de teste e, em seguida, lave.
Remova a matriz, cubra a área revestida com uma proteína de controle que possua atividade atrativa e incuba.
Isso facilita a aderência da proteína de controle às áreas vazias entre as zonas de proteína de teste, criando zonas de proteína de controle com um padrão listrado alternado e, em seguida, lave.
Adicione laminina para revestir a área listrada e depois lave.
Semeie a área revestida com uma suspensão unicelular de neurônios do hipocampo e incuba.
Na zona da proteína de teste, os neurônios interagem com as proteínas, desencadeando sinais que fazem com que os neurônios se repelam, inibindo sua fixação.
Em contraste, as interações neurônio-proteína na zona da proteína de controle promovem a ligação neuronal, apoiando seu crescimento e extensão do axônio.
Prepare as proteínas recombinantes marcadas com fluorescência em PBS. Faça 25 microlitros para cada prato listrado. Deixe a mistura incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, para cada prato, carregue uma seringa de calibre 22 com 25 microlitros de proteína diluída e injete-a através do pequeno orifício na lateral da matriz.
Evite a injeção de bolhas de ar nas matrizes, pois elas perturbarão a ligação de suas proteínas à doença.
Agora, incube os pratos por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células. Após a incubação, deposite 300 microlitros de PBS na fenda superior de cada matriz. Em seguida, aspire o PBS de um pequeno orifício localizado na lateral de cada matriz para remover todas as proteínas recombinantes não anexadas. Não aspire totalmente o PBS porque as proteínas vão secar.
Execute este enxágue PBS um total de três vezes. Em seguida, remova cuidadosamente a matriz de cada prato. Em seguida, adicione imediatamente cerca de 100 microlitros de proteína de controle em toda a área listrada, criando uma camada alternativa em cada prato.
Em seguida, incube os pratos por 30 minutos a 37 graus Celsius. Enquanto isso, no gelo, descongele a laminina em PBS a 20 microgramas por mililitro. Após 30 minutos, lave a louça três vezes com PBS. Em seguida, cubra cada prato com cerca de 100 microlitros de laminina fria e devolva os pratos à incubadora por mais uma hora.
Uma hora depois, use PBS para lavar a louça três vezes novamente. Após a terceira lavagem, adicione cerca de 150 microlitros de meio de cultura a cada prato. Em seguida, incube os pratos em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que sejam necessários. Conte as células usando um hemocitômetro e reproduza 10.000 neurônios em 150 microlitros de meios de cultura em cada placa de listra preparada. Deposite cuidadosamente a suspensão para cobrir toda a região da listra.