Imunocoloração de fluorescência de neurônios do hipocampo de ratos dentro de um chip microfluídico

Pegue um chip microfluídico contendo neurônios do hipocampo de ratos.

O chip apresenta reservatórios somáticos e axonais, com compartimentos divididos por microsulcos, compartimentando efetivamente os neurônios e isolando as regiões somáticas e axonais.

Remova a mídia e adicione formaldeído. Incubar para fixar os neurônios e preservar sua estrutura.

Remova o excesso de formaldeído e lave com tampão. Em seguida, adicione um detergente para permeabilizar os neurônios.

Substitua o detergente por uma solução de bloqueio para bloquear locais de ligação não específicos.

Remova a solução de bloqueio e incube com anticorpos primários que se ligam a marcadores sinápticos neuronais específicos, que são proteínas integrais da membrana nas vesículas sinápticas.

Remova os anticorpos não ligados e lave com tampão.

Incubar com anticorpos secundários marcados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários direcionados aos marcadores sinápticos.

Remova os anticorpos secundários não ligados e lave com tampão.

Sob um microscópio confocal, crie imagens do chip para visualizar os marcadores sinápticos neuronais fluorescentes.

Para iniciar a imunocoloração de fluorescência, remova a maior parte do meio do chip, mantendo os compartimentos internos hidratados. Imediatamente, adicione 100 microlitros de solução de fixação aos poços superiores dos compartimentos axonal e somático.

Após um minuto, adicione 100 microlitros de solução de fixação aos poços inferiores e fixe as células por 30 minutos em temperatura ambiente. Remova a maior parte da solução dos poços e adicione imediatamente 150 microlitros de PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Aguarde dois minutos para que o PBS flua para os poços de fundo e, em seguida, remova o PBS e enxágue os poços mais duas vezes usando o mesmo processo.

Após o último enxágue, remova a maior parte do PBS dos poços do chip e adicione imediatamente 150 microlitros de PBS com 0,25% de Triton X-100 a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático.

Aguarde 15 minutos e, em seguida, remova a maior parte do líquido dos poços. Adicione imediatamente 150 microlitros de solução de bloqueio a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Após 15 minutos, remova a maior parte do líquido dos poços e adicione imediatamente 100 microlitros da solução de anticorpo primário a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático.

Cubra o chip para minimizar a evaporação e incube as células no anticorpo primário por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue o chip removendo a maior parte da solução e adicionando imediatamente 150 microlitros de PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Após cinco minutos, remova o PBS de ambos os poços e repita o enxágue mais duas vezes.

Agora, remova a maior parte do líquido dos poços e adicione imediatamente 100 microlitros de anticorpos secundários em PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Cubra o chip para minimizar a evaporação e incube o chip por uma hora em temperatura ambiente. Como mostrado anteriormente, enxágue o chip três vezes com PBS. Em seguida, monte e crie imagens dos chips conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.