Modelagem de lesão neuronal em neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

Comece com uma cultura de neurônios granulares cerebelares primários de camundongos.

Adicione altas concentrações de N-metil-D-aspartato, ou NMDA, um agonista do receptor de neurotransmissor excitatório, e glicina, um co-agonista. Incube a cultura.

NMDA e glicina se ligam a seus respectivos locais nos receptores NMDA, levando à superestimulação e causando um influxo maciço de íons de cálcio.

O aumento do cálcio intracelular ativa as fosfolipas dependentes de cálcio, que degradam os fosfolipídios da membrana celular, resultando em danos à membrana.

Além disso, o cálcio intracelular ativa proteases que degradam as proteínas celulares.

Os níveis elevados de cálcio também induzem estresse mitocondrial e fragmentação, levando à liberação de espécies reativas de oxigênio, ou ROS, e causando estresse oxidativo.

Além disso, o cálcio intracelular ativa DNases, que, juntamente com ROS, causam danos ao DNA, resultando em morte neuronal.

Substitua o meio por meio novo sem NMDA e glicina para interromper a cascata de sinalização.

O modelo de lesão neuronal induzida por NMDA está pronto para análise posterior.

Para induzir a excitotoxicidade neuronal com NMDA, após sete dias in vitro, trate os neurônios do grânulo cerebelar com 100 NMDA micromolar e 10 glicina micromolar por uma hora. Em seguida, substitua o meio por meio condicionado das culturas paralelas sem tratamento. Essa concentração resulta em 50% de morte celular 24 horas após o tratamento.