Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:19 min. • July 8th, 2025
Fixe uma inserção de cultura de três compartimentos em um prato revestido de polímero para fixação das células.
Inverta o prato, marque o compartimento do meio e reoriente-o. Adicione um meio contendo interneurônios a este compartimento.
Adicione um meio contendo células endoteliais periventriculares humanas, ou PVECs, células dos vasos cerebrais, a um dos compartimentos externos.
Em outro compartimento externo, adicione um meio contendo células endoteliais não periventriculares como controle.
Adicione um meio de co-cultura ao prato para evitar a secagem do polímero. Incubar para adesão celular.
Desmonte a inserção, criando manchas retangulares de células com pequenos espaços livres de células entre cada tipo de célula.
Refresque com o meio de co-cultura e incuba.
As células endoteliais fazem com que os interneurônios migrem para espaços livres de células.
Enquanto isso, os PVECs liberam atrativos químicos que aumentam a migração de interneurônios em direção ao adesivo contendo PVEC.
A maior migração de interneurônios em direção ao adesivo de PVEC do que o patch da célula de controle confirma a resposta do interneurônio a pistas quimioatrativas dos PVECs.
Para realizar o ensaio de quimioatração, coloque uma inserção de cultura de três poços no centro de uma placa de 35 milímetros revestida com poli-L-ornitina e laminina. Vire o prato de cabeça para baixo e marque o limite ao redor do compartimento do meio do inserto usando um marcador permanente com uma ponta ultrafina.
Semeie 30.000 interneurônios GABAérgicos em 70 microlitros de meio neuronal no compartimento do meio. Em seguida, semear 10.000 células endoteliais periventriculares e 10.000 células endoteliais controle em 70 microlitros de seus respectivos meios nos dois compartimentos externos.
Adicione 1 mililitro de meio de co-cultura ao longo da lateral do prato para evitar que o revestimento do prato seque. Após 48 horas, remova a inserção e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 36 horas.